Методы очистки вирусов гриппа

Разработаны многочисленные методы очистки вирусов гриппа из аллантоисной жидкости или из культуральной среды. Выбор конкретного метода определяется требуемой степенью чистоты. Чистоту полученного вируса можно установить с помощью электрофореза вирионных белков в полиакриламидном геле (рис. 6.5), но, как и в случае всех оболочечных вирусов, почкующихся через плазматическую мембрану, даже при самой тщательной очистке невозможно избежать контаминации вируса клеточными белками. Кроме того, вирус может быть плео-морфным, что осложняет его очистку центрифугированием в градиентах плотности. Тем не менее при работе с вирусами, дающими высокий титр в культуре клеток или куриных эмбрионах, удается получить препараты, степень контаминации которых клеточными белками незначительна. На первой стадии очистки из содержащей вирус аллантоисной жидкости или культуральной среды удаляют клеточный дебрис с помощью низкоскоростного центрифугирования (10 мин при 2000—10 000 д). Все стадии следует проводить при 0°С, чтобы свести к минимуму потери инфекционности и протеолиз вирионных белков. [c.181]

Исключительно важное значение химия поверхности адсорбентов и носителей имеет в газовой и жидкостной хроматографии для анализа сложных смесей, препаративного выделения чистых веществ и управления технологическими процессами. Химия поверхности играет важную роль и в процессах, протекающих в биологических системах. К ним относится, в частности, взаимодействие биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, с рецепторами — местами их фиксации в организме. Изучение модифицирования поверхности необходимо для решения вопросов совместимости искусственных материалов с биологическими. Химическое модифицирование адсорбентов применяется при разработке эффективных методов вывода из крови разного рода токсинов (гемосорбция). Прививка к поверхности крупнопористых адсорбентов и носителей соединений с определенными химическими свойствами необходима для иммобилизации ферментов, их хроматографического выделения и очистки, а также для иммобилизации клеток. Иммобилизованные ферменты и клетки эффективно используются в промышленном биокатализе, обеспечивая высокую избирательность сложных реакций в мягких условиях. Очистка и концентрирование вирусов гриппа, ящура, клещевого энцефалита и других для получения эффективных вакцин требует применения крупнопористых адсорбентов с химически модифицированной поверхностью. [c.6]

Методы очистки вирусов гриппа [c.184]

В основе этого исключительно простого и быстрого метода концентрирования вируса гриппа лежит его способность связываться с поверхностью эритроцитов (см. разд. 3.1), что можно использовать как одностадийный метод очистки вируса (см. разд. 4.3.4). [c.184]

Метод изоэлектрической преципитации был применен ддя очистки и концентрирования аденовирусов [222], вируса африканской чумы свиней [770] и вируса гриппа [567]. [c.48]

Методы адсорбции. Еще в 1941 г. Солк [707] применил метод адсорбции я элюции на фосфате кальция для концентрирования и очистки вируса гриппа. За эго время было испытано множество разнообразных веществ, специфически сорбирующих вирусы каолин, активированный уголь, коллоидальный гипс, бентонит, окиси и гидроокиси металлов и другие минеральные сорбенты. В настоящее время для предварительного концентрирования и частичной очистки вирусов применяют лишь фосфат кальция и сульфат бария. Для концентрирования и очистки миксовирусов в настоящее время применяют метод адсорбции-элюции на эритроцитах, основанный на феномене, обнаруженном впервые Херстом [402] в 1941 г. и получившем название гемагглютинации. Процесс адсорбции вируса гриппа на эритроцитах был подробно изучен М. И. Соколовым [101] в 1949 г. Т, В. Еремеев и О. М. Чалкина [29] усовершенствовали этот метод, использовав для адсорбции формалини-зированные эритроциты. [c.44]

Ф, Г. Исупов и Н. П. Тагирова [42] проводили сравнительную очистку вирусов гриппа, кори, бешенства и аденовирусов с помощью депротеиыизации фторуглеродами. Очистка вируса гриппа фреоном-113 давала лучшие результаты по сравнению с методом адсорбции и элюции на куриных эритроцитах, но повторная обработка фреоном-113 приводила к падению титра вследствие удаления g-aнтигeнa. Авторы показали, что этот метод был эффективен только по отношению к аденовирусам. [c.89]

Удобен и эффективен метод концентрирования и очистки вируса гриппа из аллантоисной жидкости при помощи сернокислого бария [574]. Сульфат бария в виде водной суспензии (12,5 г на 100 мл дистиллированной воды) прибавляют к равному объему вируссодержащей аллантоисной жидкости и встряхивают 10 минут при комнатной температуре. Смесь оставляют на ночь при 4°. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок сульфата бария ре суспендируют в Vio исходного объема 0,25 М цитрате натрия, pH 8. Осадок перемешивают в гомогенизаторе нри комнатной температуре 5 минут. После стояния в течение ночи при 4 эяюат отсасывают, а осадок промывают 0,25 М раствором цитрата натрия, pH 8. Элюаты объединяют и центрифугируют при 800 g в течение 15 минут. После цикла дифференциального центрифугирования вирус ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2. Выход вируса составляет 70—75% при 500-кратной очистке. [c.103]

Демонстрация ключевой роли сиаловой кислоты как компонента многих гликонротеинов в их отношении к частице вируса гриппа и к вирусной инфекции (обзор см. [186]) имела большое влияние на современные исследования гликонротеинов. Можно отметить лишь немногие направления в современном развитии исследований. Многие уже известные и очищенные гликонротеины, включая групповые вещества крови и белки сыворотки, были исследованы вновь и вскоре стала очевидной широкая распространенность гликонротеинов, содержащих сиаловые кислоты. Присутствие сиаловой кислоты во многих гликопротеинах, представляющих биологический интерес, делает необходимым развитие мягких методов их выделения и очистки, поскольку кетозидная связь, соединяющая концевой остаток сиаловой кислоты с ее партнером, чувствительна даже к 0,05 п. минеральной кислоте. Ферментативное отщепление сиаловой кислоты от гликонротеинов позволило оценить ее вклад в физические, химические и биологические свойства индивидуальных гликопротеинов. Этот подход был очень плодотворным. Так, оказалось, что сиаловая кислота ответственна за низкую изоэлектрическую точку и высокую электрофоретическую подвин ность сиалогликопротеинов, за электрофоретическую подвижность эритроцитов и раковых клеток, за вязкость гликонротеинов слюны, за биологическую активность гонадотропинов и других гормонов и за правильное функционирование фактора Кэстла. По счастливому стечению обстоятельств этот рост исследований гликонротеинов происходил в то время, когда был доступен арсенал чувствительных, мощных и специфических методов исследования состава и структуры сложных белков и определения их физических свойств и химической реакционной способности. Ниже будут рассмотрены успехи, достигнутые к настоящему времени. [c.23]

Создание эффективного метода отщепления остатка нироглу-таминовой кислоты решило проблему секвенирования белков, блокированных вследствие циклизации N-концевых Gin и Glu [136]. Поскольку благодаря реакции деблокирования , протекающей с высоким выходом, становится доступной а-амино-группа последующего аминокислотного остатка, реакцию циклизации следует рассматривать как удобный способ создания защитной группы на стадиях очистки белка. Снятие защиты осуществляют путем двукратной инкубации с пироглутамат-аминопептидазой печени крупного рогатого скота. Метод был впервые использован при анализе легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, а затем при анализе тяжелой цепи гемаг-глютинина вируса гриппа [181]. [c.72]

Вирусы гриппа — это содержащие однонитевую РНК оболочечные вирусы, вызывающие серьезные эпидемические заболевания человека и многих видов животных, в частности лошадей, свиней, тюленей и домашней птицы. Известны три типа данных вирусов, выделенные на основании различий между нуклеокап-сидами в реакции связывания комплемента они отличаются также по биохимическим и биологическим свойствам. Вирусы типа А, способные к быстрым и резким изменениям антигенных свойств (антигенный дрейф), являются главной причиной пандемий гриппа человека поэтому они исследованы наиболее подробно. Большинство методов выращивания, очистки и титрования вирусов гриппа разработаны именно для вирусов этого типа. Вирусы типа В, хотя и не способны к антигенному дрейфу, по всем остальным биохимическим и биологическим свойствам очень близки к вирусам типа А поэтому их, как правило, можно выращивать и титровать, пользуясь теми же методами. С другой стороны, вирусы типа С по своим биохимическим свойствам весьма далеки от вирусов типов А и В соответственно они имеют и другие ростовые свойства. Поскольку вирусы этого типа изучены намного хуже, чем другие, в настоящей главе основное внимание уделено методам, разработанным для вирусов типов А и В, в особенности тем, с которыми авторы знакомы по собственному опыту. Тем не менее большинство этих методов применимы и к вирусам типа С. Данная глава представляет собой практическое руководство, и соответственно теоретические основы методов, как правило, не рассматриваются. При необходимости упоминаются некоторые биологические особенности вирусов и даются ссылки на соответствующую литературу однако полное описание этих свойств можно найти в недавно опубликованных подробных обзорах [1—3]. [c.161]

Поскольку вирус гриппа обычно содержится в большом объеме аллантоисной жидкости или культуральной среды, перед очисткой его необходимо сконцентрировать. Существуют различные методы концентрирования вирусов, и выбор одного из них определяется оснащенностью лаборатории. [c.183]

Имеются сообщения я о неудачах пря использовании метода ионообменной хроматографии. Например, Т. Г. Орлова и Л. С. Дискипа [71] показали невозможность элюции вируса гриппа А2 (Краснодар) с колонки с ДЭЛЭ-целлю-лозой. Аналогичные результаты получили Лэвер [499] и Цвартов с сотр, [868]. При использовании хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе для очистки вируса болезни Тешена терялось до 99% вируса [481]. [c.125]

Галловей и Шлезингер [355] в 1937 т использовали ультрафильтрацию для очистки и концентрирования вируса ящура, а В, И. Товарнйцкйй и Г. П, Глухарев [118] — для очистки и концентрирования вируса гриппа, В последнее время метод ультрафильтрации был значительно усовершенствован и получил более широкое распространение как в исследовании вирусных частиц, так и для очистки и концентрирования вирусов. [c.43]

В 1935 г. Стенли [759], применяя это вещество, впервые получил препарат вируса табатаой мозаики в кристаллическом состоянии. Впоследствии этим методом успешно подучали высокоочищенные препараты многих вирусов растений [528, 643, 784], Но для концентрирования и очистки вирусов животных он может быть применен только в качестве предварительной обработки. Дальнейшая очистка препарата, концентрированного сульфатом аммония, достигается более сложными методами. Этот метод успешно применяли для предварительного концентрирования вируса ящура, энтерита норок, Коксаки А9 и А10, полиомиелита, реовирусов, гриппа, болезни Ньюкасла, саркомы Рауса, лейкемии Раушера, везикулярного стоматита и лимфоцитарного хорио менингита [79, 230, 254, 295, 373, 452, 544, 571, 582, 629, 689, 833]. [c.46]

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности солей тяжелых металлов широко применяется при очистке и фракционировании многих вирусов Этот метод был использован для очистки вируса ящура [179, 809], европейской чумы свиней [418], полиовирусов [502,657], E HO 349], риновирусов [252], реовирусов [322, 722], оспы 449], полиомы [854], герпеса [199], гриппа [181] Однако следует отметить, что равновесное центрифугирование в градиенте плотности s l не всегда применимо для очистки вирусов Это обусловлено прежде всего тем, что он оказывает инактивирующее действие на некоторые вирусы животных, в частности на вирусы лейкемии и некоторые миксовирусы [49, 690]. [c.68]

Концентрация и очистка вирусов на ультрафильтрах. Метод концентрации и очистки вирусов с помощью ультрафильтрации имеет преимущества перед ультрацентрифугированием и дегидратацией, как наиболее мягкий и щадящий. Кроме того, пользуясь им, можно работать с большими количествами вируссодержащей жидкости и одновременно удалять сопутствующие вирусу низкомолекулярные вещества и белки. Еще в 1937 г. Галловей и Шлезингер [355] использовали ультрафильтрацию для концентрации и очистки вируса ящура. В. И. Товарнйцкйй и Г. П. Глухарев [118] концентрировали и очищали вирус гриппа на мембране с диаметром пор [c.81]