Саузерн-гибридизация

Рис. 9.7. Использование Саузерн-гибридизации для судебной экспертизы. ДНК, вьщеленная из крови пострадавшего, из пятна крови на рубашке подозреваемого и из его крови была обработана одной и той же рестрицирующей эндонуклеазой. Лестница фрагментов для ДНК, вьщеленной из пятна крови на рубашке, идентична таковой для ДНК пострадавшего и отличается от лестницы фрагментов для ДНК подозреваемого.

Гибридизация по Саузерну. Гибридизация по Саузерну позволяет получить информацию о перекрывании фрагментов различных рестрикций и "обойти" этапы поиска вилок и вложений, перейдя сразу к построению рестрикционной карты по интервальному графу (разд. 5.3). Помимо это- [c.186]

Рисунок 2. Саузерн-гибридизация клонированного ПЦР-продукта,

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Для идентификации трансгенных животных вьщеляют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий. [c.421]

Рис. 20.11. Использование рестрикционных сайтов в качестве генетических маркеров. А. Замена одной пары нуклеотидов в рестрикционном сайте приводит к тому, что рестриктаза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) и (—) соответственно. Б. Участок одной хромосомы, содержащий три сайта (А, 1 и В), узнаваемые одной и той же рестриктазой. X - расстояние между сайтами А и 1, У - расстояние между сайтами 1 и В, X + У -расстояние между сайтами А и В. Сайты А и В во всех случаях интактны (оба +), а сайт 1 может быть как интактным (+), так и измененным (-). Если сайт 1 интактен (+), то после обработки ДНК рестриктазой образуются фрагменты X и У. Если же он изменен (—), то образуется единственный фрагмент (X + V). Если провести блот-гибридизацию по Саузерну с зондом а, то мы обнаружим фрагмент X в том случае, если сайт 1 интактен (+), и фрагмент (X + V), если он изменен (-). В. Фрагменты, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации по Саузерну с зондом а, для каждого из генотипов (+/+, +/-, -/-). Г. Фрагменты одной хромосомы, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации с зондом Р или у.

Блоттинг ДНК по саузерну — процедура переноса денатурированной ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр для гибридизации с комплементарными нуклеотидными последовательностями. [c.459]

Экстракт ДНК из клеток почек или печени, полученных путем биопсии гибридизация с плазмидной ДНК по Саузерну [c.501]

Прогулка по хромосоме -это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждав-щиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрикционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК-дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотических организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в нащих знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах. [c.288]

Анализ набора фрагментов ДНК с помощью электрофореза в геле, переноса по Саузерну и гибридизации с радиоактивными зондами 1 и 2 [c.221]

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как Р или Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК [c.308]

Метод гибридизации по Саузерну, соединенный с подходами, разработанными для генетического анализа соматических клеток, с успехом применялся не только для картирования определенных генов (табл. 18.4), но и для локализации последовательностей ДНК с неизвестными функциями, найденными в библиотеках генов человека. [c.311]

Вышеописанная процедура определения хромосомной локализации генов включает в себя два основных этапа. Первый этап заключается в цитогенетической идентификации хромосом или фрагментов хромосом, присутствующих в гибридной линии клеток. На втором этапе с помощью гибридизации ДНК, в растворе или по методу Саузерна устанавливают наличие искомых последовательностей. Более прямой [c.313]

В этом разделе рассматриваются основные методы использования РНК-зондов при исследовании нуклеиновых кислот в обычной лабораторной практике. В раздел включены детальные описания методов, в которых РНК используются вместо ДНК-зондов при Саузерн- и нозерн- гибридизации и в опытах по защите от действия РНКазы. [c.27]

Таблица 1.4. Условия гибридизации по Саузерну

Метод Нозерн -гибридизации по существу идентичен гибридизации по Саузерну и детально описан в табл. 1.5. [c.29]

Если расстояния от сайта А до сайта 1 и от сайта 1 до сайта В не совпадают, каждое из них не превышает 20 т. п. н. и существует одноко-пийный зонд, гибридизующийся с участком ДНК между сайтами А и 1 (рис. 20.11, Б), то после блот-гибридизации по Саузерну и разделения в агарозном геле фрагментов ДНК, полученных в результате обработки ЯшёПТ, мы сможем различить две ситуации. Первая - сайт 1 расщепляется, в результате чего образуется два фрагмента, и зонд гибридизуется с тем из них, который ограничивается сайтами А и 1. Вторая - сайт 1 не расщепляется и зогщ гибридизуется с фрагментом ДНК, ограниченным сайтами А и В (рис. 20.11, Б). [c.453]

Саузерн-блотгипг (Southern blotting) Обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей путем переноса денатурированных молекул ДНК, подвергнутых электрофорезу, с агарозного геля на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр за счет капиллярного эффекта и гибридизации с меченым зондом, комплементарным искомой последовательности. [c.559]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии происходит замена АТ на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего Р-цепь гемоглобина человека замена происходит в сайте (СТКАО), чувствительном к рестриктазе Ойе (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием Ос1е1 у здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена Р-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике. [c.288]

Для обнаружения таких участков ДНК проводят мягкое разрушение клеток, не сопровождающееся разрушением ядер. Аликвоты ядерной фракции подвергают действию возрастающей дозы нуклеазы типа ДНКазы I, которая вносит одноцепочечные разрывы в двухцепочечную ДНК. После этого из каждой аликвоты выделяют ДНК и подвергают ее расщеплению определенной рестриктазой. Полученные препараты анализируют с помощью электрофореза и гибридизации по Саузерну [c.221]

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Результаты эксперимента по картированию гена химотрипсиногена В (СТКВ) приведены в таблице 18.3. Плюсы и минусы во втором столбце таблицы отражают результаты гибридизации по Саузерну. Следующие столбцы таблицы указывают на присутствие тех или иных хромосом человека в гибридных линиях. Единственная хромосома, которая имеется во всех гибридных клеточных линиях, дающих положительный ответ в блот-гибридизации, и отсутствует в линиях, дающих отрицательный ответ,-это хромосома 16. [c.311]

ДНК-зонды, содержащие последовательности искомых генов, дают возможность идентифицировать эти гены, даже если они и не экспрессируются. Это можно сделать с помощью таких методов, как гибридизация в растворе (достаточно устаревший подход), гибридизация по Саузерну и гибридизация in situ. [c.291]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мыщей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. [c.240]

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Затем выявляли фрагменты, в которых имелись носледовательности, кодирующие С-область L-цепи, и фрагменты с кодом для определенной V-области L-цепи (для этого исиользовали гибридизацию но Саузерну с двумя радиоактивными ДНК-зондами один из них был комплемеитареи кодирующей последовательности для V-области, а другой - для С-области мРНК для снецифической L-цепи миеломы) (разд. 18.3). В ДНК клеток миеломы последовательности, кодирующие С - и V-области, были обнаружены в составе одних и тех же фрагментов ДНК, тогда как в ДНК из эмбриона они оказались в разных фрагментах (так же как и в ДНК из другой миеломной опухоли, вырабатывавшей другую L-цепь на схеме не [c.244]

В некоторых случаях крайне желательно экстрагировать разделенные в агарозном геле фрагменты. Они могут понадобиться для исследования химическими и физическими методами, а также для установления деталей структуры рестрикционным анализом, определения последовательности оснований в ДНК, гетеродуплексно-го анализа и гибридизации с использованием эндонуклеазы [6] или блоттинга методом Саузерна [28]. Приводимая ниже методика [11] позволяет экстрагировать с хорошим выходом всевозможные интактные, биологически активные молекулы ДНК непосредственно из полос, которые они образуют в агарозном геле. Для осуществления этой операции нужен выпускаемый промышленностью препарат агаразы ( albio hem, La Jolla, alif., номер по каталогу 121811)—фермента, расщепляющего агарозу. [c.144]

Использование РНК-зондов в блот-гибридизации по Саузерну, по-видимому, увеличивает чувствительность метода — главным образом из-за отсутствия конкурентной гибридизации зонда на себя , препятствующей гибридизации зонд—мищень (такая же чувствительность может быть достигнута и при использовании кДНК или других одноцепочечных ДНК-зондов но такие зонды, как правило, сложнее получить). [c.29]

Количество копий специфической последовательности ДНК можно оценить с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Приготовление ДНК из культивируемых клеток описано в гл. 6 книги II данной серии [34], а техника переноса на иитроцеллю-лозный фильтр и гибридизации с клонированным зондом хорошо изложены в работе [27], и в данной главе мы не будем возвращаться к ним. Общая постановка эксперимента показана на рис. 8.8, [c.262]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология