Биосенсоры иммобилизации

Одним из перспективных направлений в использовании ХМЭ является модифицирование их соединениями, которые ускоряют перенос электронов с электрода на деполяризатор (или наоборот). Указанные соединения выполняют роль медиаторов сначала они принимают (или отдают) электроны от электрода, а затем участвуют в быстрых редокс-реакциях с определяемым компонентом. Эти реакции широко используются в амперометрических ферментных биосенсорах, поскольку многие ферменты являются редокс-медиаторами. Разработаны способы иммобилизации хинонов, органических и неорганических ионов, редокс-красителей, ферментов. На сегодняшний день одним из лучших медиаторов является ферроцен - Г] -бис(циклопентадиенил)железа. С электрохимической точки зрения ферроцен представляет собой классическую редокс-пару ( ° = 165 мВ относительно НКЭ), на физические и химические свойства которой можно влиять, вводя заместитель в любое из колец молекулы. [c.487]

Важной проблемой при создании ферментных сенсоров является выбор метода иммобилизации биологически активных молекул на твердой поверхности. В работе [373[ проведено сравнение чувствительности оптических биосенсоров с иммобилизованной различными способами уреазой по отношению к ионам тяжелых металлов [c.473]

Рассматривая ферменты как специфические химические преобразователи, переводящие определяемое вещество в форму, детектируемую физическими или химическими методами, удалось придумать и разработать новый класс сенсоров, для которых характерна чувствительность к биологическим соединениям. Перспективным путем повышения селективности и чувствительности и расширения возможностей этих устройств является комбинирование различных ферментов, например эстераз, дегидрогеназ и оксидаз с детекторами-полярографическими, кондуктометрическими, потенциометрическими, акустическими и оптическими. Б первых ферментных электродах ферменты физически удерживались на поверхности сенсора или в непосредственной близости от нее. Позже были предложены методы химической иммобилизации, осаждения и другие. Коферменты также физически или химически закрепляются на поверхности сенсора. Перевод фермента в нерастворимую форму как способ увеличения его времени жизни позволяют избежать осложнений, связанных с осмотическими явлениями в коллоидных растворах, особенно когда в ферментном электроде используется проницаемая для определяемого компонента мембрана В идеальном случае ферментный биосенсор должен работать непосредственно в неразбавленной цельной крови, подобно газовым и рН-электродам, в свое время произведшим революцию в анализе. [c.11]

Оптимизация характеристик тканевого биосенсора должна включать и экспериментальное изучение различных параметров сенсора. Как правило, необходимо детально рассмотреть методику иммобилизации тканевого слоя, влияние pH, активаторов и ингибиторов, срок службы и общую избирательность биосенсора. Существует несколько методов иммобилизации тканевого слоя, основанных либо на физическом его удерживании подходящей мембраной, либо на захвате химически сшитым белковым носителем. Многие тканевые материалы достаточно прочны и могут быть относительно легко иммобилизованы при помощи найлоновой сетки. В случае же гуанинового биосенсора ткань печени кролика прижимают к поверхности электрода мембраной из диацетилцеллюлозы, поскольку эта ткань не обладает достаточной механической целостностью, позволяющей использовать крупноячеистую найлоновую сетку. [c.45]

В настоящее время тонкая регулировка биохимического процесса и тщательный подбор мембранных материалов, толщины слоя ткани и методики иммобилизации являются неотъемлемыми элементами процедуры оптимизации тканевых биосенсоров. [c.47]

Специфические требования к методам иммобилизации в биосенсорах [c.78]

Иммобилизация биологических компонентов в биосенсорах 79 [c.79]

Наконец, при необходимости иммобилизации биологического компонента может оказаться, что аминокислотные остатки, обеспечивающие связь с носителем, важны гакже и для каталитической активности фермента. Тогда приходится использовать иной метод иммобилизации. Некоторые потенциальные приложения белковой инженерии в области биосенсоров перечислены ниже [c.101]

Таким образом, чтобы оптимизировать активность и время отклика системы, необходимы тщательный выбор носителя и химического способа иммобилизации. Последний также должен быть совместим с конечной конфигурацией и технологией изготовления биосенсора. Наконец, даже если выбраны подходящие носитель и реакции, используемые для иммобилизации, сама иммобилизация может вызывать уменьшение конформационной подвижности и, следовательно, активности белка. [c.112]

Отделение от окружающей среды. Обычно от носителя, на котором проводится иммобилизация, требуется, чтобы он был просто инертной подложкой для активного биологического материала. Можно, однако, представить себе случаи, когда носитель играет более активную роль. В определенных условиях он может обеспечить ферменту микроокружение, отличное от окружения в объеме раствора. Весьма похожий эффект дает обсуждавшаяся выше в этой главе поверхностная модификация белка. Положительно заряженный носитель стремится потерять протоны, так что кажущееся оптимальное для данного фермента значение pH будет ниже обычного. Аналогичным образом гидрофобный субстрат стремится проникнуть в гидрофобный носитель, что приводит к уменьшению кажущейся для этого субстрата. С другой стороны, носитель можно разместить так, чтобы исключить влияние мешающих веществ, присутствующих в анализируемой смеси. Такие эффекты довольно легко предсказывать. Особенно важными они становятся при разработке биосенсоров, удовлетворяющих самым строгим критериям. [c.112]

В заключение этого раздела, посвященного иммобилизации, мы должны упомянуть иммобилизацию коферментов [34]. Одной из проблем, возникающих при использовании биосенсоров со свободно диффундирующими коферментами, является утечка последних из сенсора. Возможный способ решения этой проблемы-иммобилизация кофермента в растворимой или нерастворимой форме. [c.113]

Следует отметить, что для систем прямого действия нет необходимости в мембране, отделяющей химические компоненты биосенсора от анализируемой жидкости, если рецептор предохраняется иммобилизацией на поверхности оптического зонда. Тем не менее наличие мембраны все же желательно, чтобы защитить рецепторный белок от некоторых компонентов внешнего раствора, например ферментов. [c.508]

Если холинэстераза иммобилизована с помощью ковалентного связывания, то срок службы биосенсора возрастает Так, датчик, состоящий из рН-электрода с иммобилизованной на поверхности ацетилхолинэсте-разой (путем сшивки глутаровым альдегидом с альбумином), функционирует без изменения характеристик достаточно длительное время. С его помощью определяли паратион и севин на уровне 10 - 10моль/л Продолжигельность анализа 30 мин. Содержание паратиона и севина контролировали по относительному снижению отклика сенсора после внесения в ячейку аликвоты пробы. Заметим, что величина измеиения pH зависит не только от активности фермента, но и от буферной емкости раствора. Поскольку увеличение кислотности происходит лишь на мембране, а в объеме раствора pH остается практически постоянным, обычно применяют высокие (до 0,1 моль/л) концентрации субстрата и ячейки большого (100 мл и выше) объема. Кроме глутарового альдегида для иммобилизации холинэстеразы используют сополимеры акрил- и метакриламида, желатин. В последнем случае стеклянный шарик рН-электрода погружают в 5-10%-й раствор желатина, содержащий фермент, затем высушивают и обрабатывают водным раствором глутарового альдегида. Аналогичные мембраны используют и в датчиках на основе рН-чув-ствительных полевых транзисторов (911. [c.294]

Слой мышечной ткани кролика толщиной 0,5 мм содержит приблизительно пять международных единиц АМР-деаминазной активности [10]. В то же время сравнимый объем (25 мкм) коммерческого препарата фермента имеет активность всего 0,1 ед. Такая низкая активность и приводит к плохой чувствительности ферментных биосенсоров. Фактически перед иммобилизацией выделенный фермент приходится концентрировать фильтрацией в течение 16 ч и в результате активность ферментного слоя на поверхности электрода повышается до 0,9 ед. [35]. Но даже после такого концентрирования ферментативная активность в слое ткани остается выше примерно в пять раз. В табл. 3.4 приведены основные характеристики сенсоров АМР на основе различных биокаталитических материалов. Наилучшие эксплуатационные характеристики, в том числе наклон 58 мВ/рС и срок службы не менее 28 дней, достигаются при использовании кусочка ткани, который обладает наибольшей ферментативной активностью из всех приведенных материалов. Напротив, система на основе фермента характеризуется наклоном, составляющим только 46 мВ/рС и всего лишь четырехдневным сроком службы. Таким образом, если выделенные ферменты имеют недостаточную специфическую активность, то более эффективны слои ткани. [c.44]

Если мы поставим задачу выяснить, какие требования предъявляются к методам иммобилизации биологических компонентов в биосенсорах, то в начале списка требований будут фигурировать адаптируемость, надежность также возможность связывания биологического компонента с сенсором через молекульТ, которые проводят электроны. Хотя в биосенсорах требуются очень малые количества биологического компонента, все же чем он чище, тем выше надежность. Он, (очевидно ) не должен содержать других веществ, которые могли бы взаимодействовать с используемым для анализа или другими ферментами, катализирующими реакции с образованием продуктов, детектируемых выбранным электродом. Для обеспечения надежности требуется также 1) высокая специфичность биологического компонента 2) устойчивость системы к колебаниям температуры, ионной силы, pH, окислительно-восстановительного потенциала и химического состава окружающей среды 3) встроенное приспособле-ние(я), ограничивающее загрязнение или биологическую деградацию биокомпонента или способа его присоединения ) должна быть исключена возможность инфицирования пациента (часто это достигается при помощи сенсоров со сменными компонентами). [c.78]

При иммобилизации биологического компонента биосенсора мы особенно заинтересованы в таких методах, которые применимы к разнообразным поверхностям. Это расширяет возможности выбора подложки и гарантирует, что не потребуется ее модифицировать, [Многие поверхности, на которых проводится иммобилизация, имеют гидроксильные группы, присоединенные к ним непосредственно либо через атомы углерода, кремния и других элементов. Этим и объясняется широкая применимость метода иммобилизации, включающего обработку поверхности тетрахлоридом титана, промывание водой и приведение в контакт с биокомпонентом. В результате между подложкой и биологическим компонентом получается титановый хелат типа сандвича. Такой хелат не подвержен биологическому распаду и устойчив в широком диапазоне pH, в котором проявляется активность биокомпонентов. Кроме того, подложки с -МНз- и другими группами могут вести себя по отношению к атомам титана как лиганды. Начальная обработка поверхности тетрахлоридом титана служит для активации, и если необходимо, на этой стадии активированную поверхность можно высушить. После того, как активированную поверхность промыли водой и молекулы воды заместили хлоридные лиганды, поверхность уже нельзя сушить, а необходимо сразу привести в контакт с биокомпонентом1 [3]. Из всех соображений наиболее важным, по-видимому, является требование, чтобы в иммобилизованном состоянии биологический компонент проявлял максимальную активность, сравнимую с активностью в растворе. Первые методы иммобилизации в большинстве своем сильно снижали активность (до 1-2%), тогда как при помощи тетрахлорида титана для многих ферментов достигается активность выше 50%.) [c.79]

Как и в случае любых приборов, основанных на использовании ферментов, возникает вопрос об устойчивости. Уже накоплен довольно большой опыт по использованию люцифераз, иммобилизованных на различных подложках. Препараты люциферазы светляка пока еще недостаточно устойчивы для применения в биосенсорах, однако устойчивость бактериальной люциферазы постоянно улучшается по мере появления лучших методов иммобилизации. Теперь бактериальную люциферазу можно использовать в нескольких сотнях циклов, полагая при этом, что фермент не изменился по сравнению с исходным. Сможет ли на практике этот фермент служить так долго, как немногие известные долгожители , остается предметом дальнейшего исследования. [c.501]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология