Методы определения неспецифической сорбции

Преимуществами метода Касаи и Ишии [10] являются его чувствительность и простота для исследования необходимо лишь небольшое количество белка по сравнению с методом Данна и Чейкена [7] в этом методе концентрация фермента очень мала относительно Кй использование фронтального анализа упрощает выведенные уравнения объемы элюирования можно определить более точно, поскольку они практически не зависят от концентрации. При использовании этого метода для определения констант диссоциации химотрипсина на сфероне, к которому был привязан с помощью гидрофобного гексаметилендиамина N-бензилоксикар-бонилглицил- D-фенилаланин, Туркова и др. [15] встретились с трудностями, обусловленными, очевидно, неспецифической сорбцией. [c.54]

Хроматографический анализ — совокупность методов разделения однородных многокомпонентных смесей, основанных на использовании сорбции в динамических условиях. Это физический метод разделения, при котором разделяемые вещества распределяются между двумя фазами. Одна из фаз неподвижна, другая — подвижна и фильтруется через слой неподвижной фазы. Разделение основано на различиях коэффициентов распределения компонентов смеси между подвижной и неподвижной фазами, это в свою очередь вызывает различия в скорости переноса компонентов по длине неподвижной фазы. Поток подвижной фазы вызывает дифференцированную миграцию компонентов смеси из первоначальной зоны в пористую сорбционную среду неподвижной фазы. После хроматографического разделения вещества могут быть количественно определены многими, в том числе неспецифическими методами. Хроматографический анализ — это гибридный метод, сочетающий разделение и детектирование (определение). Разделение и количественное определение часто осуществляют в одном приборе — хроматографе. [c.92]

Этот метод основан на использовании специфичности взаимодействия, лежащего в основе биологической функции фермента. В качестве избирательного адсорбента используются иммобилизованные иа носителе ферменты или ингибиторы (лиганды). Иммобилизованный фермент избирательно связывает соответствующий ингибитор, а иммобилизованный ингибитор избирательно связывает соответствующий фермент. Связь между иммобилизованным ферментом и ингибитором осуществляется обычно за счет нековалентных связей разного типа (водородные связи, комплексообразование, межмолекулярные специфические и неспецифические взаимодействия). Контакты между молекулами данного фермента и соответствующего лиганда (ингибитора), обусловливающие высокую избирательность сорбции, программируются определенным пространственным расположением функциональных групп именно данного фермента, его уникальной геометрической и химической структурой. Фермент связывается с ингибитором по типу ключ — замок . В этом смысле говорят о комплементарности молекулярных структур иммобилизованного фермента и ингибитора. Десорбция фиксированного так фермента или ингибитора легко осуществляется обычно соответствующим изменением pH элюента. [c.249]

Из работы Нишикавы и Бэйлона [49] следует важный вывод, касающийся этого метода и заключающийся в необходимости поддержания температуры между 4 и 10°С во время реакции активации бромцианом, в то время как реакция связывания аффинного лиганда может проводиться при комнатной температуре. В ряде гелей е-аминокапроновую кислоту связывали в различных условиях и определяли ее количество титрованием или по содержанию азота. Во всех случаях при действии бромциана включалось больше азота, чем можно было бы ожидать из содержания связанной е-аминокапроновой кислоты, определенной титрованием включение превышало расчет в отношении от 3 1 до 9 1. Превышение включения азота против расчетного возрастало с увеличением температуры активации (при 2°С оно составляло 3,3 раза, при 4°С—4,9 раза, а при 20°С—8,3 раза). Поскольку при 2 °С активация протекает очень медленно, такие условия нельзя использовать на практике. При 10 °С наилучшим образом сочетаются достаточно высокая скорость активации и минимальное число побочных процессов. Побочные реакции, сопровождаемые повышением содержания азота в препаратах иммобилизованных лигандов, являются одним из источников катионных групп, которые приводят к неспецифической сорбции. Этот вопрос детально обсуждается в разд. 10.3. Лоу и Дни [41] отмечали, что активированные гели содержат хотя и в небольших, но существенных количествах бром, что можно объяснить присутствием в препаратах бромциана трибромтриазина, который может участвовать в реакции связывания. [c.194]

Как правило, выделение и очистку мембранных белков проводят в присутствии детергентов. Присутствие дигитоннна или додецилсульфата натрия в небольших концентрациях не влияет на эффективность аффинной хроматографии. Однако в каждом конкретном случае необходимо учитывать влияние детергента на процесс сорбции, элюирования и особенно на метод определения биологической активности, применяемый до нанесения образца на колонку. Использование буферных растворов, не содержащих детергентов, может привести к неспецифической сорбции белка на сорбенте вследствие его агрегации, что существенно повлияет на степень очистки. [c.185]

Достоинствами данной модификации ИФА являются 1) отсутствие твердой фазы 2) быстрота разделения компонентов реакционной системы (I тип) 3) экспрессность при сохранении высокой чувствительности (время определения IgG человека в концентрации Ю" М не превышает 10 мин) 4) возможность быстрого анализа антигенов с различной молекулярной массой. К основным недостаткам, снижающим универсальность метода, относятся возможность неспецифической сорбции соединений на полианионе или поликатионе и необходимость сга<9ыы промывки нерастворимого поликомплекса при определении ферментативной активности в осадке. [c.112]

Из вышеизложенного следует, что кроме природы нерастворимого носителя существенную роль играет также метод связывания. В табл. 8.12 дан обзор методов связывания, рассмотренных в разд. 8.2 и 8.3. При выборе методов связывания главное внимание уделяется тому, какие группы аффинного лиганда можно использовать для присоединения к нерастворимой матрице без затрагивания связывающих участков аффинных лигандов. Если доступно несколько групп, рекомендуется выбрать наиболее избирательный метод, потому что желательна специфическая связь через одну определенную функциональную группу. Присоединение не должно приводить к появлению в специфическом сорбенте неспецифически сорбирующих групп. Поэтому лучше привязывать к аффинному лиганду пространственную группу и только модифицированный таким образом лиганд присоединять к нераствори-мовду носителю. В результате образования связи между поверхностью нерастворимого носителя и аффинным лигандом не должно возникать ни в носителе, ни в аффинном лиганде неспецифически сорбирующих групп эта связь должна быть устойчивой в ходе сорбции, десорбции и регенерации (см. разд. 8.5). При выборе метода необходимо принимать во внимание также зависимость устойчивости аффинного лиганда от pH. Кислые протеина-зы, например, нельзя связывать в щелочных средах, поскольку они будут при этом инактивироваться. Поэтому в табл. 8.12 приводится также значение pH, при котором проводится связывание. Однако во многих методах могут быть получены хорошие результаты даже при низких pH (связывание в нейтральной среде на [c.229]

Другой подход — это выявление в ядерных экстрактах белков, способных специфически связываться с определенными участками ДНК. Для этого экстракты, выделяемые обычно из ядер с помощью 0,2—0,4 М солевых растворов, инкубируют с клонированными фрагментами меченой ДНК в присутствии избытка немеченой неспецифической ДНК (например, из Е. oli). Комплексы ДНК с белками выявляют либо путем их сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах, либо наблюдая замедление миграции данного, фрагмента при гель-электрофорезе. Зная рестриктный фрагмент, с которым специфически взаимодействуют белки ядерного экстракта, можно далее выявить участки этого фрагмента, защищаемые связанным белком от атаки нуклеазами (ДНКазой I, экзонуклеазой) или химическими агентами (например, диметилсульфатом). Для этого после мягкой обработки расщепляющими агентами фрагменты ДНК (меченные предварительно по одному концу) разделяют с помощью электрофореза в геле вместе с обработанными тем же методом препаратами свободной ДНК. Сравнивая полученные наборы продуктов расщепления, легко определить участки ДНК, защищаемые белком с точностью до одного нуклеотида (рис, 31), [c.168]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология