Культуры эукариотических клеток

Гены, кодирующие несколько вирусных белков слияния, были клонированы и затем использованы Оля трансфекции эукариотических клеток в культуре. Трансфицированные клетки экспрессировали вирусные белки на поверхности мембраны. При кратковременной инкубации при низких pH эти клетки сливались между собой, образуя гигантскую многоядерную клетку. Для наиболее изученного белка слияния из вируса гриппа была определена трехмерная структура методом рентгеноструктурного анализа (см. разд. 8.6.12). Было показано, что при низком pH в белке слияния индуцируются крупные конформационные изменения, приводящие к экспонированию предварительно спрятанной гидрофобной области на поверхность белка. При этом становятся возможными его взаимодействия с липидным бислоем мембраны-мишени. По-видимому, кластер таких гидрофобных областей расположенных в близком соседстве друг с другом в молекуле белка слияния, приводит два липидных бислоя в тесное соприкосновение и дестабилизирует их так что бислои сливаются (рис. 6-87). [c.424]

Контрансфекция ( ontransfe tion) Введение в одну эукариотическую клетку двух разных молекул ДНК. В случае системы экспрессии на основе бакуловирусов — процедура одновременного введения бакуловируса и вектора в клетки насекомых в культуре. [c.551]

Представление об изменчивости и наследственности бактерий нельзя составить без знания некоторых положений молекулярной генетики прокариотической клетки. В основе процессов приспособления микробных культур к изменяюшимся экологическим условиям лежат изменчивость и наследственность, являющиеся разделами генетики бактерий. При изложении цитологии бактериальной клетки уже рассматривалась структура ДНК и РНК и их роль в жизни клетки. Характерное строение ДНК сохраняется у каждого вида и передается потомству из поколения в поколение, как и другие признаки. ДНК бактерий представляет собой двунитчатую спираль, замыкающуюся в кольцо. Кольчатая нить ДНК бактерий, расположенная в ну-клеоиде, не содержит белка. Такое кольцо ДНК соответствует хромосоме эукариотической клетки. Известно, что в хромосоме эукариотических клеток, кроме ДНК, всегда содержится белковый компонент. Отсюда следует, что понятие хромосомы у эукариотов несколько отлично от понятия хромосомы бактерий. Нить ДНК, представляющая собой хромосому бактерий, разумеется, у разных видов различается. Сахарофосфатный компонент ДНК у всех видов бактерий одинаков расположение азотистых оснований и их комбинация, напротив, различаются у разных видов. [c.102]

Эукариотические гены одних видов были также клонированы и экспрессировались в клетках других видов. Например, ген, кодирующий tx-цепь гемоглобина кролика, был введен в растущие в культуре мышиные клетки и экспрессировался в них. Внедрение чужеродного гена в эукариотические клетки не всегда, однако, сопровождается его транскрипцией и трансляцией с образованием активного белка. Регуляция экспрессии генов у эукариот пока еще мало изучена (разд. 29.22) во время написания этой книги проводится большое число исследований по выяснению условий экспрессии реком-бинантньк генов в эукариотических клетках. [c.988]

Эукариотические клетки характеризуются более высоким содержанием нуклеиновых кислот по сравнению с прокариотическими, поэтому микопротеин содержит значительное количество нуклеиновых кислот (5-15% сухой массы). Это главным образом РНК, причем ее содержание желательно снизить, поскольку употребление человеком более 2 г в день может привести к образованию камней в почках или к подагре. Для удаления РНК культуру прогревают при 64 °С в течение 20-30 мин в особом сосуде, через который пропускают горячий пар. [c.79]

Метод напоминает бактериальную трансформацию. К эукариотическим клеткам, растущим в культуре, добавляют ДНК. У клеток, включивших эту ДНК, проявляются новые фенотипические признаки. А. Эукариотиче- [c.25]

Дупликации генов увеличивают общее количество ДНК в клетке и создают возможность для приобретения генами в процессе эволюции новых функций. Дуплищ1рованные гены входят в состав генома потомков носителя предкового гена. Другими словами, предковый и дуплицированные гены входят в состав генофонда одного и того же вида. На первый взгляд эволющ1я посредством включения гена, возникшего в одном виде, в генофонд другого вида невозможна поскольку виды репродуктивно изолированы друг от друга, они эволюционируют как независимые общности. Однако уже несколько десятков лет известно, что прокариоты способны включать чужеродную ДНК посредством процессов трансформащ1и и трансдукции. Хорошо также установлено, что эукариотические клетки в культуре ткани способны включать ДНК другого вида (см. гл. 18). Недавно получены данные, свидетельствующие о том, что гены могут переходить от одного эукариотического организма к другому и даже от эукариот к прокариотам, хотя такое явление должно происходить очень редко даже в эволюционном масштабе времени, если оно вообще происходит. [c.251]

Использование ретровирусов в качестве векторных молекул за последние годы обрело статус наиболее перспективного и универсального метода введения и экспрессии клонированных генов в эукариотических клетках. Многие свойства ретровирусов делают их более удобными для таких исследований, чем методы прямого генетического переноса или использование потенциальных вирусных векторных систем. Во-первых, относительно небольшой геном ретровирусов позволяет довольно просто с ним манипулировать и вводить в его состав чужеродные гены таким образом, чтобы любой возникаюш,ий при этом дефект вирусной репликации мог бы комплементироваться по транс-схеме. Во-вторых, вирусы можно легко нарастить в культуре до высокого титра. Эффективность инфицирования пермиссивных клеток чрезвычайно высока, что в сочетании с высоким титром вирусных препаратов позволяет получать в культуре почти 100%-ное заражение клеток-мишеней. После инфицирования единственная копия ретровирусной ДНК оказывается стабильно интегрированной в геном клетки-хозяина строго определенным образом, так что практически все инфицированные клетки способны экспрессировать гены, привнесенные вирусом. Кроме того, ретровирусы содержат мощные транскрипционные знхансеры, которые существенно повышают уровень экспрессии клонированных генов в клетках различных типов. [c.272]

Микроворсинки щеточной каймы в тонком кишечнике и стереоцилии, ответственные за рецепцию звука,-относительно постоянные специализированные образования, характерные для определенных типов эпителиальных клеток. В то же время очень многим эукариотическим клеткам свойственны динамичные поверхностные структуры-такие, например, как упоминавшиеся ранее микроворсинки, быстро образующиеся на поверхности яйцеклетки морского ежа после оплодотворения. Клетки, растущие в культуре, тоже нередко образуют множество волосовидных выростов, называемых микрошипами, толщиной около 0,1 мкм и длиной от 5 до 10 мкм. Обычно это происходит тогда, когда клетка прикрепляется к твердому субстрату, мигрирует или округляется перед делением (рис. 10-58). У кончика растущего аксона нервной клетки возникают еще более крупные микрошипы, называемые филоподиями их длина достигает 50 мкм (см рис. 18-63). Описанные структуры способны быстро вытягиваться и втягиваться-возможно, за счет локальной полимеризации и деполимеризации актиновых филаментов, что, однако, еще достоверно не установлено. Эти филаменты в микрошипах ориентированы так же, как в микроворсинках кишечного эпителия, но расположены гораздо менее упорядоченно (рис. 10-59). Предполагают, что микрошипы служат сенсорными приспособлениями, с помощью которых клетка исследует свое окружение (см. гл. 18). [c.112]

Если в результате мутации или действия специфического ингибитора активность какого-то важного генного продукта становится недостаточной, то часто обнаруживаются мутантные клетки, в которых данный генный продукт синтезируется в большем, чем обычно, количестве. У многих таких клеток имеются многочисленные тандемные повторы соответствующего гена, в результате чего продуцируются избыточные количества мРНК и соответствующих полипептидов. Способностью к такой амплификации генов обладают как бактерии, так и разнообразные эукариотические клетки в культуре. Амплификация происходит и в опухолевых клетках. Как правило, это довольно редкие события остается посмотреть, как часто наблюдается амплификация в нормальных соматических клетках. [c.306]

Использование катионных липидных реагентов. В последние годы разработаны катионные липидные реагенты (липофектин, ли-пофектамин, селфектин и др.), которые обеспечивают простое, быстрое и воспроизводимое введение молекул нуклеиновых кислот в культивируемые клетки млекопитающих и насекомых. Раствор ДНК просто смешивают с фирменным катионным липидным реагентом и наносят на монослой культуры клеток (рис. 13.2). При этом эффективность введения ДНК в эукариотические клетки обычно превышает таковую при использовании ДЭЛЭ-декстранового или кальций-фосфатного методов. [c.335]

В лаборатории Е. Неймана в 1982 т. для введения чужеродных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки разработан метод электропорации. Показано, что обработка клеток животных электрическими импульсами с напряженностью поля 5-10 кВ/см в течение 5-10 мкс приводит к поглощению клетками молекул ДНК, находящихся в среде. При этом по частоте получения стабильных генетических трансформантов — 70-80 на 10 клеток на 1 мкг ДНК — электропорация сравнима с такими популярными биохимическими методами, как кальций-фосфатный и ДЭАЭ-декстрановый. Метод электропорации благодаря своей простоте привлек внимание многих исследователей и стал активно внедряться в практику. Постепенно усилиями разных лабораторий процедура электропорации была оптимизирована. Оказалось, что для большинства изученных культур клеток животных оптимальными условиями являются напряженность прилагаемого электрического поля — 2-2,5 кВ/см время воздействия — около 1 мс комнатная температура среда, содержащая физиологические концентрации солей, включая катионы Са2+ и Mg2+. Электропорация представляет собой относительно универсальную простую процедуру трансформации (трансфекции) клеток животных. Достоинством электропорации является [c.337]

Если библиотека кДНК создана в экспрессирующем векторе, то каждый клон будет продуцировать особый белок и тогда представляющие интфес клоны можно идентифицировать не по их нуклеотидной последовательности, а по их белковым продуктам. При этом в качестве зонда для клонов обычно применяют радиоактивно меченные антитела. Иногда вместо этого можно провести прямой тест, выявляющий биологическую активность продукта данного гена. Особенно эффективен этот метод при поисках эукариотических генов, ответственных за секретируемые факторы роста. Можно, напримф, клоны кДНК из клеток, вырабатывающих определенный фактор роста, ввести в экспрессирующий вектор, размножающийся в клетках млекопитающих. Смесь трансфицированных клеток, содержащих много таких различных клонов, выращивают на небольшой чашке, где каждая клетка, в которой экспрессируется данный ген, выделяет этот фактор роста в среду. Затем пробы среды испытывают на присутствие данного фактора роста, добавляя их к культурам других клеток, способных реагировать на этот фактор. Тест отличается настолько высокой чувствительностью, что положительный ответ получают даже в том случае, когда в исходной культуре одна клетка из тысячи содержит ген, кодирующий данный фактор роста. Повторное тестирование позволяет отыскать в смеси тот единственный клон, который продуцирует этот фактор. Таким способом удалось открыть ранее неизвестные факторы роста и выделить их за [c.336]

Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в эукариотические клетки в культуре. Молекулы можно инъецировать непосредственно в отдельные клетки, однако проще вводить клонированные молекулы в больщую популяцию клеток одновременно. Нри этом используется методика трансфекции, описанная в гл. 5 в связи с клонированием в эукариотических клетках. Но крайней мере часть молекул, введенньи таким способом, достигает ядер. [c.354]

Адгезивность и инвазивность определяют на культурах тканей Нвр-2 или НеЬа (см. подразд. 1.3.4, 3.1). Для этого бульонную культуру бактерий в логарифмической фазе суспензируют в культуральной среде и в строго определенном количестве вносят в емкости с монослоем эукариотических клеток. Через 3 ч инкубирования при 37 °С в присутствии СО2 клетки ткани отмывают фосфатным буфером, фиксируют и окрашивают (для определения индекса адгезивности) или покрывают свежей культуральной средой, содержащей гентамицин (для уничтожения внеклеточно расположенных бактерий), и продолжают инкубировать в течение 1 ч, после чего многократно промывают монослой, фиксируют и окрашивают его клетки (для определения индекса инвазивности). Индексы вычисляют как среднее количество микробных клеток, взаимодействующих с одной эукариотической (при этом изучают не менее 100 эукариотических клеток в препарате). [c.144]

Для культивирования используют перевиваемые клеточные культуры (наиболее чувствительными являются клетки L-929, НеЬа, МсСоу), в которых хламидии образуют характерные цитоплазматические включения. Клетки обрабатывают цитостатиками (циклогексимидом) или облучают для того, чтобы обеспечить более полное усвоение хламидиями АТФ и других продуктов метаболизма эукариотических клеток. [c.245]

Каждый вид микроорганизма может быть представлен рядом штаммов. В генетике микроорганизмов термином штамм обозначают генетически однородную культуру определенного вида, выделенную из одной клетки и отличающуюся от других штаммов происхождением, а часто и рядом признаков, несущественных для систематики. Штамм, выделенный из природы, называют диким типом. Одним из основных методов генетического анализа микроорганизмов является метод клонирования культуры. Клон — это генетически однородное потомство, полученное при размножении одной клетки (у прокариот) или вирусной частицы. У эукариотических микроорганизмов клон — потомство одной клетки (споры), делящейся митотически. [c.173]

У микроорганизмов в экспоненциальной фазе роста культуры скорость деления хромосомы (у бактерий) или ядер (у эукариотических клеток) обычно опережает скорость деления клеток. Поэтому для проявления возникших мутаций, большинство из которых являются рецессивными, необходим так называемый сегрегационный лаг-период, в течение которого происходит образование клеток, содержащих только мутантные хромосомы или ядра. Кроме того, для проявления некоторых мутаций необходим дополнительный фенотипический лаг-период. Например, для проявления мутаций устойчивости к фагу у Е. oli необходимо, чтобы все рецепторы клеточной стенки заменились на мутантные. Это происходит только после двенадцати дополнительных делений. В связи с этим суспензию клеток микроорганизма, обработаннук> мутагеном, необходимо подрастить в течение определенного периода времени. Длительность этого периода зависит как от скорости деления клеток, так и от специфики роста. Например, для микроорганизмов, клетки которых при росте образуют цепочки или гроздья, этот период больше, чем для штаммов, растущих в виде одиночных клеток. [c.179]

Один из основных методов молекулярной генетики-это трансформация эукариотических клеток в культуре с помощью рекомбинантных векторов, содержащих гены, кДНК и специфические мутантные копии природных сегментов ДНК. Этот метод лежит в основе многих экспериментов, описанных в данной книге. Если исследуются бактериальные или дрожжевые клетки, то манипуляции проводятся на целых организмах, пусть и одноклеточных. Корректируя мутации, мы проводим своего рода терапию на уровне генов (генотерапию). Распространение методов обратной генетики и генотерапии на диплодные организмы, размножающиеся половым путем, требует решения сложных методологических и экспериментальных проблем. [c.362]

Смотреть страницы где упоминается термин Культуры эукариотических клеток: [c.336] [c.411] [c.264] [c.257] [c.257] [c.223] [c.229] [c.359] [c.421] [c.370] [c.411] [c.264] [c.475] [c.241] [c.109] [c.137] [c.219] [c.147] [c.111] [c.241] [c.118] [c.145]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология