Дансилирование

Рис. 23. Расположение дансилированных аминокислот на полиамидной пластине после хроматографии в двух (/, 2 —на А) или трех (/—5 —на Б) системах растворителей

Помимо а- и е-аминогрупп дансилхлорид вступает в реакцию с ОН-группами тирозина, 5Н-группами цистеина и имидазольными кольцами гистидина (два последних соединения неустойчивы при щелочных значениях pH), а также с аммиаком, растворенным в воде. При взаимодействии ДНС—С1 с аммиаком образуется дансилсульфо-намид (ДНС-ЫНг). При щелочных значениях pH, дансилхлорид подвергается гидролизу с образованием дансилсульфоновой кислоты (ДНС—ОН). После окончания реакции дансилирования модифицированный белок или пептид подвергают кислотному гидролизу. Боль- [c.148]

В одном из углов пластины на расстоянии 1 см от краев наме-чают простым карандашом точку старта. Такую же точку ставят с противоположной стороны пластины. Необходимо, чтобы эти точки совпадали. В точку на одной стороне пластины наносят смесь стандартов, а в точку на другой стороне — анализируемый образец. Образец и стандарты наносят в минимальном объеме — 5—10 мкл, постоянно подсушивая место нанесения струей теплого воздуха. Наносят от 0,5 до 3 нмоль дансилированных аминокислот. Пластину ставят в маленькую хроматографическую камеру, следя за тем, чтобы она не касалась стенок камеры, и хроматографируют в растворителе I. Пластины высушивают в струе теплого воздуха в течение 30 мин и хроматографируют в перпендикулярном направлении в растворителе 2. После высушивания пластины просматривают под ультрахемископом. Обычно описанная процедура обеспечивает разделение почти всех ДНС-аминокислот (рис. 23). [c.153]

Для более полного разделения дансилированных производных треонина и серина, а также производных аспарагиновой и глутаминовой кислот проводят хроматографию в растворителе 3, в том же направлении, в котором проводили хроматографию в растворителе 2. [c.153]

Реактивы для проведения реакции дансилирования аминокислот (с. 149) или реактивы для определения аминокислот с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах Фиксион (с. 133). [c.155]

В полученных образцах определяют свободные аминокислоты. При тонкослойной хроматографии на пластинах Фиксион (с. 133) требуется не менее 10—30 нмоль аминокислот, для определения с помощью аминокислотного анализатора —2—5 нмоль аминокислот. Можно предварительно провести реакцию дансилирования (с. 148), а затем идентифицировать модифицированные аминокислоты с помощью тонкослойной хроматографии (в этом случае надо иметь 0,5—5 нмоль дансилированных аминокислот). При количественном определении аминокислот можно исследовать зависимость освобождения их от времени инкубации образца с карбоксипептидазой. [c.156]

Одно ИЗ преимуществ дансилирования по сравнению с динитро-фенилированием состоит в том, что после кислотного гидролиза ДНС-белка аминокислоты могут быть идентифицированы электрофоретически или хроматографически сразу после расщепления белка без экстракции гидролизата. Другим преимуществом является очень высокая чувствительность. Максимум возбуждения флуоресценции ДНС-аминокислот находится около 550 нм, их флуоресценция настолько интенсивна, что с помощью электрофореза на бумаге легко можно определить 1—5, а с помощью тонкослойной хроматографии 0,2—1,0 нмоль ДНС-производного. [c.275]

ДНС-производное К-концевого Три полностью разрушается в ходе гидролиза. Поэтому полностью отрицательный результат в опытах по дансилированию аминокислот может свидетельствовать [c.281]

Динитрофенилированием или дансилированием водной фазы после встряхивания с бензальдегидом можно определить С-концевую аминокислоту в виде соответствующего ДНФ- или ДНС-производного. Этот метод особенно удобен для белков, когда концентрация свободных аминокислот в водной фазе весьма мала. [c.291]

На следующей стадии ДНС-пептид гидролизуется (5,7 н. H I, 105 С, 12—16 ч) и освобождается N-концевая а-ДНС-амино-кислота. Кроме того, в результате дансилирования боковых групп остатков лизина и тирозина могут получаться ё-ДНС-лизин и О-ДНС-тирозин. [c.38]

ВЫХ оснований с последующим восстановлением боргидридом натрия д) гуанидирование (до производных гомоаргинина) е) карбамоилирование, а также дансилирование. Последняя реакция широко используется при анализе первичной структуры белков и пептидов (см. с. 37), а также для введения флуоресцентной метки в белки. Все перечисленные реакции могут применяться и для модификации N-концевой аминогруппы белков и пептидов. [c.161]

Патаки и Ванг [586] воспользовались хроматографией дан-силамииокислот на полиамидных слоях для количественных определений путем оценки флуоресценции пятен этих соедине-ций непосредственно на хроматограммах. Гердай и др. [3911 использовали дансилирование бычьих каротидных пептидных комплексов. Авторы провели 150 опытов по двумерной тонкослойной хроматографии на целлюлозе, силикагеле и полиами- [c.101]

Покровский А.А.,Медведев Ф.А.,Меламед Д.Б.,Костюковский Я.Л.-ЖАХ,1978,Д, 11/7,1396-1400. Хромато-масс-спектрометрический метод определения микроколичеств N-нитрозаминов в виде дансиламидов. (Описана методика получения дансиламидсв денитрозированием нитрозаминов действием нвг в уксусной кислоте с последующей обработкой образовавшихся вторичных аминов, либо путем дансилирования соответствующих аминов. ГЖХ-анализ при 260-290°, НФ 07-17 на хромосорбе Q, либо капиллярная колонка с SE-30. Предел обнаружения 1нг/мкл.) [c.320]

Важная роль Са + в регуляции метаболизма все более увеличивает число примеров использования флуоресценции для изучения этого процесса. Кальмодулин — белок, регулирующий Са-чув-ствительность многих клеточных ферментов, является мощным модулятором клеточных (мембранных) процессов. Долгое время" исследователи не находили методов, позволяющих контролировать его функции. Оказалось, что при взаимодействии с кальцием кальмодулин переходит в активное состояние, изменяя свою конформацию этот конформационный переход отражается на параметрах флуоресценции хромофора, если таковой присоединить к молекуле кальмодулина. Простой способ сделать функции каль-модулина видимыми — дансилирование. Дансил-кальмодулин обладает специфическим спектром флуоресценции, чувствительным к присутствию двухвалентных ионов, а также белков и мембранных липидов, с которыми он способен связываться. Таким образом, можно оценить связывание с кальмодулином гидрофобных лигандов. [c.83]

Разработан метод гидролиза пироглутамигювой кислоты с образованием N -метилглутамина [125]. Защищенный пептид инкубируют в 17%-пом растворе метиламина при 37°С в течение 14 ч (или более). После дансилирования и последуюнюго гидролиза идентифицируют ДНС-глутаминовую кислоту. [c.73]

Введение дансильной метки в непротонированиую а-аминогруп-пу пептида (рис. 11.1) проводят в щелочной среде в смешанном водно-оргаиическом растворителе (органический компонент для растворения дансилхлорида). В этих условиях конкурирую два процесса — дансилирование и гидролиз дансилхлорида — [c.366]

Растворяют пептид в небольшом объеме 1%-ного водного триэтиламина (фирма Pier , для секвенирования ). Небольшую аликвоту ( 1 мкл, 0,5 нмоль) с помощью калиброванной микропипетки (1—5 мкл) переносят на дно ампулы (при необходимости центрифугируют, чтобы жидкость стекла со стенок). Ампулы для дансилирования (4x50 мм) вытягивают из стеклянных трубок, так чтобы дно их было коническим, и перед употреблением прокаливают в течение ночи при 500—600 °С (гл. 8). [c.369]

Водную фазу высушивают и растворяют в 1%-ном триэтиламине. Часть раствора берут на дансилирование, остаток высушивают и проводят слсдующт1й цикл деградации по Эдману, Если необходимо прервать процесс, то делают это всегда после стадии расщепления. [c.373]

Традиционный метод пептидных карт обычно не позволяет разделить вариабельное ядро нерастворимых пептидов, а электрофоретически нейтральные пептиды недостаточно хорошо разделяются при электрофорезе. В том и другом случае могут быть не замечены существенные различия в первичной структуре близко родственных белков. Частично эти трудности можно преодолеть, присоединяя к пептидам дансилхлоридЭто вещество ковалентно связывается со свободными аминными, фенольными, имидазольными и сульфгидрильными группами. Дансильные производные обладают флуоресценцией от интенсивно-желтого до желто-оранжевого цвета, которая позволяет выявлять наномо-лярные количества пептидов. Кроме того, дансилирование делает пептиды более гидрофобными, что улучшает их разделение при двумерной хроматографии в тонком слое силикагеля в различных системах органических растворителей. [c.84]

Дансилхлорид той квалификации, которая требуется при анализе последовательности аминокислот, в виде 10%-ного (вес/объем) исходного раствора в обезвоженном ацетоне или кристаллического препарата а также дансилирован- [c.84]

К триптическому перевару в 0,2 мл 0,1 М ТЭЛ-бикарбонатно-10 буфера (где обычно содержится до 100—200 нмоль пептидов) прибавляют 0,8 мл 0,1 М ТЭА с pH 12 pH полученной смеси, определяемый стеклянным электродом, должен на этом этапе достигать 10,5—11. Затем к смеси добавляют 1 мл 20 мМ раствора дансилхлорида в ацетоне (100—200-кратный молярный избыток). Склянку, завернутую в алюминиевую фольгу для защиты от света, заполняют азотом, плотно закрывают и встряхивают на смесителе Vortex (pH этой смеси должен быть 10—10,5). Дансилирование пептидов производят при 37°С в течение 2 ч за это время pH снижается до 9—9,5. В конце реакции добавляют 10— 25 мкл ЗМ КОН, чтобы перевести возможный избыток дансил-хлоридных групп в данс-ОН. Оранжево-желтый цвет первоначального раствора дансилхлорида должен на этом этапе смениться бледно-желтым. Затем pH смеси дансилированных пептидов доводят до 3,5 по индикаторной бумаге, добавляя 50—150 мкл ледяной уксусной кислоты. [c.87]

Ни один метод картирования не дает абсолютно воспроизводимых результатов, и дансильный метод не составляет исключения. Хотя в повторных опытах с дансилированными триптическими гидролизатами общая картина повторяется, детальное сопоставление возможно только при параллельном анализе изучаемых белков. Необходимым контролем служит хроматография смеси различных дансилированных триптических гидролизатов, с помощью которой можно выявлять хроматографические аномалии и идентифицировать химически различные пептиды. [c.93]

Рис. 85. Связывание Са + с кальмодулином. По оси ординат показано изменение флуоресценции дансилированного кальмодулина — величина, пропорциональная связыванию Са + с кальмодулином. А — прямые координаты, Б — те же данные, представленные на графике Хилла. 1 — в отсутствие ионов 2 — в присутствии

Справочник химика 21

Химия и химическая технология