Седиментация препаративное ультрацентрифугирование

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Очень компактное и вместе с тем полное руководство по применению ультрацентрифугирования в современных биологических исследованиях. После краткого исторического обзора и описания наиболее распространенных ультрацентрифуг автор последовательно рассматривает принципы и возможности оптических систем, используемых в аналитических центрифугах, способы измерения коэффициентов седиментации и диффузии, важнейшие методы определения молекулярной массы, основы количественного анализа смесей, а также методы препаративного ультрацентрифугирования. [c.4]

С помощью препаративного ультрацентрифугирования выделено несколько типов рибосом, функционирующих в клетках различных организмов. Тип рибосомы определяется седиментационными свойствами, в частности константами седиментации, выражаемыми в единицах Свед-берга. Большинство рибосом имеют мол. в. (2,8—5)10 и содержат от 40 до 65% РНК. Так, в цитоплазме клеток дрожжей, высших растений и животных присутствуют рибосомы с константой седиментации 80 S, содержащие 40—50% РНК и характеризующиеся молекулярным весом (4—5)10 . Основным типом рибосом бактерий и сине-зеленых водорослей являются рибосомы 70 S с мол. в. (2,8—3)10 . [c.459]

Секториальная форма, изображенная на рис. 11.4, Б, позволяет использовать седиментацию для количественных измерений, хотя, как мы скоро увидим, значительно усложняет математическую обработку эксперимента. Ячейками для исследуемого вещества при препаративном ультрацентрифугировании по традиции служат цилиндрические пробирки отнюдь не секториальной формы. Поэтому некоторое количество молекул растворенного вещества теряется на стенках пробирок — эффект, который необходимо учитывать при [c.226]

Различают аналитические и препаративные ультрацентрифуги. Аналитические ультрацентрифуги имеют оптическую систему, которая позволяет регистрировать на фотопленках результаты ультрацентрифугирования. В аналитических ультрацентрифугах производится также определение констант седиментации частиц, что позволяет затем рассчитывать их молекулярные веса. [c.125]

Если коэффициенты седиментации компонентов отличаются сильно (скажем, в три раза и больше), то хорошее разделение достигается при ультрацентрифугировании в угловом роторе. Оно широко применяется на первых этапах фракционирования при больших объемах исходного раствора. Для лучшего разделения часто проводят повторное фракционирование. Когда величина коэффициента седиментации, скорректированная в соответствии с условиями препаративного эксперимента, примерно известна, возникает вопрос о выборе ротора, скорости и длительности вращения. Тротман [15] [c.189]

В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле. [c.59]

При определении 5 с помощью зонального центрифугирования часто используют стандартные образцы (маркеры), значения з которых предварительно были определены методом аналитического ультрацентрифугирования. Однако даже в том случае, когда концентрация достаточно низка, чтобы можно было не принимать во внимание концентрационную зависимость седиментации (которая может достигать большой степени, если материал недостаточно чист), определение с помощью зонального центрифугирования имеет подводные камни, которые не встречаются в аналитическом ультрацентрифугировании. Это можно объяснить тремя основными причинами. Во-первых, плотность и вязкость раствора увеличивается вдоль пробирки, поэтому суммарная сила, действующая на молекулу, здесь уже не является простой функцией расстояния. Во-вторых, стенки препаративных пробирок параллельны, поэтому они не совпадают с направлением седиментации, в результате чего происходит седиментация по стенкам с накоплением вещества. Это накопление приводит к локальным инверсиям плотности, вызывая некоторую конвекцию. В-третьих, значение 8 рассчитывается только по двум точкам, положению при времени, равном нулю, и после остановки центрифуги, так что истинная скорость движения остается неизвестной. Первая причина может быть рассмотрена очень сложным теоретическим путем, вторая теоретически описана, однако влияние ее на 5 до конца не установлено. Для избежания трудностей, связанных с первой причиной, обычно применяют изокинетические градиенты, т. е. концентрацию и плотность градиента подбирают таким образом, чтобы молекулы двигались с постоянной скоро- [c.311]

При описанном выше ультрацентрифугировании пики, наблюдаемые при помощи шлирен-системы, отвечают границам между раствором и растворителем. Первые, быстрые пики отвечают компонентам, движущимся в окружении более медленных компонентов (фиг. 8). В биохимических смесях некоторые из этих медленных компонентов (например, рибосомы при анализе бактериального экстракта) создают большую вязкость. Измеряемые коэффициенты седиментации могут при этом очень сильно отличаться от приведенного к стандартным условиям значения Поэтому полученные при помощи скоростной седиментации значения s не всегда можно непосредственно использовать при планировании и анализе данных препаративного зонального центрифугирования в градиентах плотности. При зональном ультрацентрифугировании анализируемая смесь наносится в виде слоя на раствор с увеличивающейся по направлению ко дну плотностью (что предотвращает конвекционное перемешивание) и различные компоненты седиментируют в градиенте плотности в виде отдельных зон. Для наслоения смеси можно использовать специальную аналитическую ячейку, в которой техника наслоения принципиально не отличается от обычного препаративного наслоения на градиент. Одна из таких ячеек (Be kman Instruments In .) приведена на фиг. 15. Преимущества применения такой ячейки, как отмечают Виноград и Брунер [11], состоят в том, что она требует меньше исследуемого материала, анализируемые компоненты в ней пространственно разобщены, медленные примеси отстают от быстрее движущихся зон и седиментацию последних можно осуществлять в любом растворителе, не прибегая к предварительному диализу. Растворитель должен быть более плотным по сравнению с [c.67]

Определение коэффициента седиментации в препаративной ультрацентрифуге, В большинстве случаев коэффициент седиментации для многих вирусов животных невозможно определить в аналитической центрифуге, так как для проведения подобных измерений требуются значительные количества изучаемого агента в очищенном виде. В таких случаях для вычисления коэффициента седиментации вирусов используют косвенные методы. При этом скорость осаждения вирусных частиц определяют, измеряя инфекционпость вируссодержащей суспензии после ультрацентрифугирования. Для мелких вирусов коэффициент седиментации можно довольно точно определить в препаративной ультрацентрифуге. При исследовании крупных вирусов возможны ошибки, так как крупные вирусы могут прилипать к стенкам центрифужной пробирки во время ультрацентрифугирования. [c.16]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология