Полипептиды, экспрессия в ol

Тот факт, что для превращения полипептидного предшественника в активный продукт необходима модификация этого предшественника, создает возможности для посттрансляционной регуляции потока генных продуктов. Подобные модификации особенно широко распространены среди множества полипептидов, которые служат межклеточными медиаторами в многоклеточных организмах. Такие полипептидные гормоны, как инсулин, циркулируют в крови и осуществляют координацию работы отдаленных клеток. Другие пептиды короткодействующие , они влияют на активность клеток, расположенных вблизи секретирующей клетки. Например, пептидные нейромедиаторы передают информацию от одной нервной клетки другой. Все пептидные медиаторы работают сходным образом независимо от того, распространяется ли их действие на большие расстояния (инсулин) или они действуют локально (нейромедиатор энкефалин). В любом случае медиатор вначале связывается с высокоспецифичным рецептором, расположенным на поверхности определенной клетки-мишени, запуская те или иные процессы в зависимости от свойств клеточного рецептора. Это может быть процесс роста, секреция другого полипептида, экспрессия определенного гена, возбуждение нейрона, специфические поведенческие реакции и т.д. [c.357]

В самое последнее время был разработан новый метод прямого определения структуры и последовательности аминокислотных остатков в полипептидах с помощью масс-спектрометрии, создавший основу для экспресс-метода анализа первичной структуры белков (М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников, А. А. Кирюшкин, Н. С. Вульфсон). [c.514]

Большой интерес представляют исследования по созданию новых экспресс-методов синтеза полипептидов. К ним относятся работы Д. Г. Кнорре, предложившего метод синтеза пептидов в водном растворе без выделения промежуточных соединений, распространенный недавно на синтез аминокислотных производных нуклеиновых кислот. Новые возможности открывает и метод синтеза пептидов на полимерном носителе недавно был предложен метод синтеза пептидов на полимере в растворе, имеющий ряд преимуществ в сравнении с ранее известным твердофазным методом с помощью синтеза на полимерной подложке недавно был получен ряд природных пептидов, в частности гипертензии (Л. А. Щукина). [c.515]

В тех же случаях, когда речь идет о перекрывающихся или альтернативных формах экспрессии, следует переиначить замечание, которым мы закончили гл. 1. Вместо того чтобы говорить один ген-один полипептид , следует сказать один полипептид - один ген . Тогда мы можем считать геном последовательность (включая не только [c.54]

В клетках взрослого животного глобиновый тетрамер состоит из двух идентичных а-цепей и двух идентичных р-цепей. Гены а- и р-глобинов кодируются независимыми генетическими локусами, экспрессия которых должна быть скоординирована таким образом, чтобы обеспечить продуцирование одинаковых количеств каждого из двух полипептидов. Таким образом, эта система представляет собой пример того, когда для поддержания определенного фенотипа клетки необходимо осуществление одновременной регуляции работы генов, расположенных в разных участках генома. [c.268]

Экспрессия эукариотических полипептидов в Е. соИ [c.103]

Клетки Е. соИ в естественных условиях не секретируют больших количеств белка. Однако они продуктивно секретировали ряд эукариотических полипептидов в периплазматическое пространство и несколько полипептидов в культуральную среду (табл. 4.24). Уровни экспрессии невысоки (<1% от суммарного белка клеток Е. соИ) по сравнению с таковыми при внутриклеточной экспрессии, однако здесь требуется меньшая степень очистки, чем в случае цитоплазматических продуктов. [c.131]

Кроме того, экспрессия гетерологичных генов позволяет получать новую информацию о природе и активности чужеродных полипептидов. Так, экспрессия в дрожжах области виру- [c.208]

Митохондрии располагают своим собственным аппаратом для хранения и экспрессии их генетической информации. Эта информация, содержащаяся в митохондриальной ДНК, включает программы для синтеза специальных митохондриальных транспортных и рибосомных РНК. Кроме того, в митохондриальной ДНК запрограммировано несколько полипептидов, участвующих в выполнении основных функций митохондрий. В их числе некоторые из субъединиц цитохром оксидазы и АТФ-синтазы. Однако ббльшая часть белков программируется в ядре и синтезируется в цитоплазме вне митохондрий. Это же полностью относится к белкам, обслуживающим генетический аппарат митохондрий к митохондриальным ДНК- и РНК-полимеразам, к белкам митохондриальных рибосом, которые резко отличаются от цитоплазматических рибосом и по своим основным характеристикам приближаются к рибосомам прокариот, а также к аминоацил—тРНК-синтетазам, катализирующим аминоацилирование митохондриальных тРНК. Следовательно, митохондрии должны располагать механизмом для транспорта в них широкого спектра белков, синтезируемых в цитоплазме. То же в общих чертах можно отнести и к функционированию генетического аппарата хлоропластов. [c.434]

М. М. Шемякин, Ю. А, Овчинников разработали методы синтеза полипептидов на полимерном носителе, послужившие началом создапия в СССР экспресс-методов синтеза полипептидов в промышленных масштабах. Ю. А. Овчинни ков с сотрудниками развил работы по анализу пространственной структуры пептидов и белков с помощью спектральных и расчетных методов. [c.696]

С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки — продукты генов животных и-их вирусов. Так,,, были созданы штаммы Е. соИ, у которых 20% всего- клеточного белка составляли коровый антиген вируса гепатита В, гор -МОН роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из сконструированных штаммов В. suhtblis-последний составлял около 1% синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем непросто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транскрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме-высокий уровень экспрессии генов прокариот. Причины такой. неэффективной экспрессии не всегда ясны, но в некоторых случаях удалось установить, что протеазы бактерий быстро разрушают белки животных и вирусов. В подобных ситуациях можно повысить выход, применяя несодержащие протеаз мутанты.. При выработке проинсулина, предшественника инсулина, неко торая защита от протеаз обеспечивается тем, что полипептид, секретируется в периплазматическое пространство у клеточной стенки Е. oll. На N-конце молекулы препроинсулина находится последовательность гидрофобных аминокислот, с помощью которой (с одновременным ее отщеплением) осуществляется транспорт этой молекулы через мембрану в периплазм [c.319]

Карта делеций и вставок в участке ДНК, соответствующем гену white, изображена на рис. 6.17. Как уже упоминалось, она складывается из двух функциональных областей. Левая область, включающая и лежащие слева от нее мутации содержат много мутаций, качественно влияющих на пигментацию глаза. Считается, что этот участок кодирует некоторый пока еще неизвестный полипептид (или полипептиды), ответственный за пигментацию глаз. Все мутации в правой области сопряжены с сильными изменениями нормальной последовательности ДНК. Их фенотипическое действие лучше всего можно себе представить, считая, что они влияют на проявление (экспрессию) левой области гена white. Хотя граница между левой и правой областями четко не установлена, однако мы знаем, что область, кодирующая полипептид, и управляющая область содержат по крайней мере по 7000 н. п. или несколько больше. Исследование хромосомных перестроек, лежащих справа и слева, но не затрагивающих сам ген white, дают верхнюю оценку его размера-примерно 14000 н.п. ДНК. [c.184]

Целый ряд человеческих генетических заболеваний связан с изменениями в экспрессии генов а- и р-подобных глобиновых кластеров. К таким заболеваниям относится талассемия, при которой наблюдается в той или иной степени выраженное нарушение баланса синтеза а- и р-глобиновых цепей, приводящее к анемии различной тяжести. Классификация талассемических заболеваний основана на том, какие из генов оказались подвержены изменениям в уровне экспрессии. В случае а-та-лассемии различают формы а и а° в зависимости от того, происходит или вовсе не происходит синтез каких-либо а-глобиновых полипептидов. Аналогичным образом в случае Р-талассемии различают формы Р и р°. На основании изучения множества случаев талассемии можно утверждать, что мутации, вызывающее это заболевание, могут влиять на экспрессию соответствующих генов на любом уровне, начиная от стадии инициации транскрипции и до сплайсинга трансляции мРНК и образования стабильных глобиновых цепей. [c.233]

Имеются два общих подхода к осуществлению внутриклеточной экспрессии клонированных генов. Соответствующий ген может быть клонирован в одной рамке считывания с синтетическими или бактериальными кодирующими последовательностями и экспрессироваться с образованием гибридного белка. Другой способ — непосредственная экспрессия встроенного гена. Потребность в экспрессии эукариотических полипептидов в составе гибридных белков возникла, когда было обнаружено, что уровень экспрессии эукариотических белков в клетках Е. oli ограничивается по той причине, что они распознаются клеткой как чужеродные и разрушаются [9]. Это особенно наглядно проявилось в случае полипептидов небольшого размера. При сшивании эукариотического гена с бактериальным синтезировались гибридные продукты, которые накапливались в клетке в значительно больших количествах [10, 11]. Однако, если требуется получить эукариотический полипептид в чистом виде, возникает необходимость в методе, позволяющем правильно расщепить гибридный белок. С другой стороны, непосредственная экспрессия одного эукариотического гена дает возможность получить нужный белковый продукт. Однако первичные продукты трансляции несут на своем Ы-конце остаток метионина. В клетках Е. соН имеются ферменты, осуществляющие при необходимости эффективное отщепление метионина от природных белков однако в случае рекомбинантных белков эти ферменты работают не столь эффективно [1]. Таким образом, белки, полученные в результате прямой экспрессии эукариотического гена, могут содержать несвойственный природному белку N-концевой метионин. [c.98]

Белки, имеющие в своем составе сигнальную последовательность, способны секретироваться через цитоплазматическую мембрану Е. oli в периплазматическое пространство или по направлению к наружной мембране клетки и далее во внеклеточную среду. Экспрессия чужеродных белков с последующей их секрецией имеет некоторые преимущества перед экспрессией белков, остающихся внутри клетки. Если сигнальная последовательность подвергается правильному процессингу, концевая аминокислота рекомбинантного белка будет идентична его природному аналогу. Секреция в периплазму может также предотвратить деградацию полипептида. Самое большое преимущество систем экспрессии такого типа состоит в том, что в процессе секреции формируются дисульфидные связи и образуются имеющие правильную конформацию активные продукты. [c.98]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Экспрессия гетерологичных полипептидов также может служить удобной тест-системой для исследований в области физиологии и биохимии дрожжей. Так, например, ген -галактозидазы Е. соИ использовали в дрожжах для изучения таких вопрссов, как 1) ядерные системы адресованного транспорта 2) функционирование промоторов 3) механизмы секреции. [c.208]

Помимо цитсплазматической экспрессии дрожжевые системы позволяют секретировать гетерологичные белки в культуральную среду. Существует несколько причин, по которым секреция белкового продукта оказывается предпочтительной. Многие из человеческих белков, представляющих терапевтический интерес, секретируются клетками одних типов, тогда как действие их направлено на другие клетки. Эти белки часто бывают богаты цистеином, а множественные дисульфидные связи как раз служат основным препятствием для успешной ренатурации полипептидов, продуцируемых Е. oli. [c.209]

Первый набор мутантов НА, которые были проанализированы экспрессией в рекомбинантах SV40-HA, имел делеции в последовательностях, кодирующих N- и С-терминальные гидрофобные участки белка. Эти участки играют решающую роль в транспорте НА в пределах инфицированной клетки. N-терминальная сигнальная последовательность требуется для векторного переноса образующегося полипептида через мембрану эндоплазматического ретикулума завершенный белок погружен своей С-терминальной гидрофобной последовательностью в липидный двойной слой клеточной мембраны или вирусной оболочки. [c.179]

Очень существенна информация об экспрессии на поверхности лимфоцитов иглокожих и оболочников отдельных полипептидов или полноценных антигенраспознающих рецепторов, гомологичных соответствующим молекулярным структурам Т-клеток млекопитающих. Эти факты прямо указывают на механизм распознавания чужеродности у беспозвоночных. [c.431]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология