Электрофорез в полиакриламидном геле ПЭГ, ПААГ

ПААГ-электрофорез - полиакриламидный гель-электрофорез [c.111]

В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации pH буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. [c.4]

Полиакриламидный гель (ПААГ) — наиболее эффективный носитель для электрофореза белков, в том числе и мембранных не удивительно, что большинство периодической литературы по белковому составу мембран посвящено электрофоретическому разделению последнего именно в ПААГ. Как правило, электрофорез в ПААГ проводят или в колонке, или на пластинках геля. [c.113]

Присутствие ММФ в препаратах НАД-киназы из скелетных мышц кролика было продемонстрировано также при фракционировании на колонке с сефадексом С-200 (3), а значения молекулярных весов олигомеров фермента были уточнены с помощью метода электрофореза в линейном градиенте концентрации полиакриламидного геля (ПААГ) [16]. Результаты, полученные при исследовании фермента двумя указанными методами, показали, что в частично очищенных препаратах НАД-киназы присутствуют олигомеры фермента с молекулярными весами 31000, 65000, 94 ООО, 60 ООО, 220 ООО, 350 ООО. Наименее ассоциированной формой НАД-киназы является белок с молекулярным весом 31 ООО, который, по-видимому, можно считать субъединицей фермента на том основании, что после обработки додецилсульфатом натрия двух низкомолекулярных фракций, снятых с колонки (31 ООО, 5 000), и последующего электрофореза на электрофореграммах не был обнаружен белок с молекулярным весом, меньшим 30 ООО. [c.138]

Фрагменты ДНК, полученные тем или иным методом, разделяют с помощью электрофореза в гелях (агарозном, полиакриламидном — ПААГ), из которых их экстрагируют, вырезая соответствующие участки геля, эти участки геля, например агарозного, расплавляют в пробирках при 68°С и ДНК экстрагируют фенолом, затем концентрируют изобутанолом, переосаждают этанолом и проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов При не- [c.192]

Они выглядят как большие, преломляюш,ие свет агрегаты, часто расположенные на полюсах клетки. О накоплении нерастворимого белка в процессе наращивания клеточной массы можно судить по появлению таких включений, а также с помощью ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). [c.101]

Молекулярную массу интактного олигомера определяют в неденатурирующих условиях с помощью методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ). Устойчивость и растворимость большинства олигомерных белков зависит от ионной силы и pH буферного раствора. В отличие от электрофореза в ПААГ,. где на состав буферных растворов накладываются определенные ограничения, в част1юсти ионная сила не должна превышать 0,1, гель-фильтрацию можно вести в буферных растворах стабилизирующих олигомер (например, в присутствии ионов металлов или кофакторов). Для определения молекулярной массы белков применяют классический вариант гель-фильтрации на сшитых декстранах, полиакриламиде или агарозе. В последнее время получены гели нового типа, позволяющие вести процесс при повышенном давлении, благодаря чему время анализа сокращается с 1—2 сут до 30 мин (гл. 6). [c.17]

Для определения молекулярной массы мономеров используют электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии ДСН и гель-фильтрацию в классическом и современном (ВЭЖХ) вариантах. Предпочитают использовать электрофорез в ПААГ или ВЭЖХ, однако в настоящее время ВЭЖХ уступает электрофорезу по качеству разрешения близких по молекулярной массе белков (гл, 6). Белки, содержащие более 10% углеводов, рекомендуется хроматографировать на агарозных гелях, так как электрофорез может не дать точных результатов из-за различия в связывании ДСН с полипептидной цепью и полисахаридными фрагментами. Следует также напомнить, что мономер может включать несколько полипептид-ных цепей, связанных дисульфидными связями, поэтому определение молекулярной массы следует проводить как до, так и после восстановления 5—5-мостиков. [c.26]

Ниже описываются три общепринятых метода разделения нептидов. Первый из них ПААГ — ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), обычно в одномерном варианте. Разрешение пептидных фрагментов достигается благодаря различиям в их относительных подвижностях, не всегда отражающих истинные молекулярные массы. Очень важно, что электрофореграмму фрагментов одного белка можно сравнивать с электрофореграм- [c.223]

Поскольку гель-фильтрация дает безусловно лучшие выходы при разделении крупных пептидов, чем ионообменная хроматография, оптимальный метод расщепления белка в двухстадийном анализе (рис. 10.2) удобно выбирать на основе результатов аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС), При четком разделении полос в геле целесообразно для препаративного фракционирования пептидов применять гель-фильтрацию. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН используется также для ко1ггроля полноты процесса расщепления белка химическими реагентами. [c.349]

Однако методы прямого химического анализа мембранных белков не только не потеряли своего значения, но успешно разрабатываются. Одним из перспективных методов в настоящее время является метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием додецил-сульфата натрия (508) в качестве диссоциирующего агента. Этот детергент в высоких концентрациях (>0,1 %) соединяется с полипептидами и препятствует их агрегации. [c.257]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Этот метод был существенным щагом вперед по сравнению с обычными методами анализа белков, известными к тому времени. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе - полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сщивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецнл-сульфат натрия или ДСН (8В8) (рис. 4-48). [c.215]

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

Электрофорез в ПААГ нативного белка проводили в блоках полиакриламидного геля в системе Андерсон, Борг и Микаэльсон (1972) и в системе со сдвигом заряда (Колесниченко и др,, 2000), [c.10]

Электрофорез в ПААГ с ДДС-Na проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN П ( Bio-Rad , США), согласно инструкции производителя. Окрашенные после электрофореза гели использовали для флюорографии в присутствии 2,5-дифенилоксазола, [c.10]

Электрофорез в ПААГ нативного белка в градиенте пористости геля Электрофорез проводят в блоках полиакриламидного геля размером 110x100x1 мм (Anderson et al., 1972) (Рис. 16). [c.58]

Определение видовой специфичности необходимо для выявления в культуре примесных клеток, а также для анализа процессов, происходящих при культивировании клеток и при создании клеточных гибридов. Эта задача может быть решена с помощью изофермент-ного анализа [1]. По принятому сейчас определению, изоферментами являются ферменты с одинаковой субстратной специфичностью, которые представляют собой результат экспрессии одного или нескольких структурных генов, имеющихся в геноме вида. Изоферменты могут отличаться друг от друга по своим физико-химическим параметрам, например по заряду, что позволяет разделять их с помощью электрофореза (ЭФ) в крахмальном, агарозном или полиакриламидном (ПААГ) гелях [2] (подробно об ЭФ см. [3, 4]). В данном сообщении основное внимание уделено методам ЭФ и последующего анализа спектра изоферментов применительно к проблемам типиро-вания клеточных культур. Процедура состоит из следующих этапов [c.98]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология