Белки определение молекулярной массы

Ультрацентрифугирование растворов полимеров. Ультрацентрифуги, в которых развиваются центробежные ускорения, превышающие ускорение силы тяжести в десятки тысяч раз, широко применяются для изучения свойств макромолекул в растворах. Впервые этот метод был использован Т. Сведбергом для определения молекулярных масс белков. [c.153]

Метод определения молекулярной массы по величине осмотического давления нашел широкое распространение для высокомолекулярных веществ. Измерение величин других коллигативных свойств в этом случае нецелесообразно, так как закон Рауля выполняется только при очень малых концентрациях растворенных высокомолекулярных веществ, при которых чувствительность мала например, 0,001 т раствор белка с молекулярной массой М=10 000 дальтон содержит 1 г вещества в 100 г воды. [c.147]

В 1923 г. шведский химик Теодор Сведберг (1884—1971) сконструировал центрифугу и разработал седиментационный метод определения молекулярной массы макромолекул, главным образом белков. [c.128]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9. [c.45]

Концентрация раствора эквивалентна 20 г белка на 1 кг воды, но вследствие высокой молекулярной массы моляльность раствора оказывается равной всего 0,0016. Поэтому Т = - 1,86 0,0016 = - 0,003°С, по эта величина слишком мала для точного определения молекулярной массы. [c.145]

Гель-хроматографию используют для определения молекулярных масс (М) белков, полимеров, углеводородов и др. При этом используют линейную зависимость объемов выхода вещества от его молекулярной массы [c.240]

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах , в которых удается создать центробежные ускорения [c.44]

Молекулярную массу затем рассчитывают, подставляя целую часть вычисленного значения zi в уравнение 9.4-26. Существуют более точные компьютерные алгоритмы, которые преобразовывают полученный масс-спектр в спектр, состоящий из одного пика, соответствующего молекулярной массе белка. Определение молекулярной массы белка важно само по себе, например вследствие того, что молекулярная масса может легко указать на природу рекомбинантного продукта. [c.308]

Все перечисленные особенности коллоидных растворов являются препятствием для применения к ним и таких методов, как криоскопия и эбулиоскопия. В отличие от лиофобных золей растворы высокомолекулярных веществ (т. е. лиофильные коллоиды) уже при сравнительно небольших концентрациях показывают измеримые величины осмотического давления. Это привело к разработке ряда методов определения молекулярной массы для веществ с М от 10 тыс. до 200—300 тыс, а в особых случаях до 1 млн., включая такие важные вещества, как белки, каучуки, полисахариды и т. д. [c.374]

Белки с определенной молекулярной массой (Да) яичный альбумин (45 000), бычий сывороточный альбумин (68 000), рибо-нуклеаза из поджелудочной железы (12 700), цитохром с (13 000). [c.107]

При определении молекулярной массы по методу седиментационного равновесия знание коэффициента диффузии не является необходимым. В этом случае используют более низкое число оборотов. По сравнению с предыдущим методом, для которого необходимо гравитационное поле до 400 ООО g, здесь достаточно центробежной силы, в 10 — 15 тыс. раз превосходящей земное притяжение. Через несколько часов или через несколько суток процесс седиментации и обратной диффузии достигает состояния равновесия, при котором перемещение частиц отсутствует. Измерив градиент концентрации белка от мениска до дна ячейки, можно вычислить его молекулярную массу. Медленное установление равновесия — недостаток метода. Этого можно избежать при проведении определения по Арчибальду. В этом низкоскоростном методе для расчетов можно использовать градиент концентрации, образующийся в измерительной ячейке у мениска жидкости (до отделения белковой зоны). Метод нулевой концентрации в мениске, предложенный в 1964 г., делает возможным достижение седиментационного равновесия при высокой скорости ротора (высокоскоростной метод), в этом случае белковая зона уже отделена от мениска. Это дает возможность сократить время эксперимента до 2 — 4 ч. [c.361]

Такая методика исследования применялась для определения молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот и для изучения их строения в адсорбционном слое. Этот метод позволяет получить ценные сведения о конформации молекул в поверхностном слое, поскольку эта последняя определяет величину площади, занимаемую ими в двухмерной пленке. Чтобы не вводить поправку на взаимное притяжение молекул в адсорбционном слое, эти измерения проводят в той области значений pH, в которой молекулы заряжены вследствие ионизации. Конформация белка зависит от pH среды, которое определяет диссоциацию ионогенных групп и их гидратацию. При изменении pH изменяется и наклон прямых т. е. величина (рис. П-19). [c.80]

Измерение осмотического давления является одним из методов определения молекулярных масс, позволяющих в современных мембранных осмометрах определять М. до 10 (каучук, целлюлоза, белки). [c.192]

Некоторые коллоиды состоят из вполне определенных молекул с постоянной молекулярной массой и вполне определенной молекулярной формой, что позволяет им образовывать кристаллическую структуру. Белки имеют молекулярную массу от десяти до нескольких сот тысяч. [c.269]

П. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ [c.116]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

В период между 1925 — 1930 гг. Сведберг с помощью ультрацентрифугирования произвел определение молекулярных масс различных белков. Одновременно применение других аналитических методов, как, например, электрофореза и различных видов хроматографии, привело к развитию аналитической белковой химии. В 1951 — 1956 гг. Сенгер [20, 21] установил аминокислотную последовательность инсулина. Использованные при этом методы легли в основу систематического определения первичной структуры многих белков. Созданный Эдманом в 1966 г. секвенатор и применение масс-спектрометрии в сочетании с ЭВМ как средством регистрации, обработки и оценки масс-спектрометрических данных привели к тому, что к настоящему времени опубликовано более 15 ООО работ, посвященных определению аминокислотных последовательностей, и установлены первичные структуры более чем для 1000 белков. [c.343]

При помощи градуировочной кривой, полученной при элюировании стандартных белков с различной молекулярной массой, и используя простейшее аппаратурное оформление, можно провести определение молекулярной массы с погрешностью 5 — 10%. [c.361]

Из-за зависящей от концентрации тенденции многих белков к агрегации или диссоциации на субъединицы определение молекулярных масс становится проблематичным, интерпретация результатов различных физикохимических методов часто также является сложной. Обычно суммируют значения для различных фракций и затем делят полученную величину на число частиц в растворе или относят среднюю величину не к числу, а к средней массе частиц. Метод ультрацентрифугирования позволяет найти среднюю молекулярную массу. [c.362]

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью. [c.46]

Раствор, содержащий смесь двух и более веществ, отличающихся по размеру молекул, а следовательно, и по молекулярной массе, вносят в колонку, заполненную гелем с сетчатой структурой и уравновешенную буферным раствором. Наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты раствора, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы гелевой фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь геля, непрерывно обмениваются между жидкими фазами внутри и вне геля и продвигаются по колонке значительно медленнее. Находящиеся в растворе самые маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними. На этом принципе основаны методы фракционирования белков и других полимеров, их обессо-ливание, определение молекулярной массы, замена одних буферных растворов другими и др. [c.106]

Принцип метода заключается в том, что на кинетическое движение молекул в растворе и равномерное их распределение накладываются большие центробежные силы, в результате чего белок седиментирует ко дну пробирки. Се-диментационное равновесие и скорость седиментации, которая регистрируется оптическим методом, являются функциями молекулярной массы белка. Определение молекулярной массы по скорости седиментации описывается следующим уравнением [c.44]

Для точного определения молекулярной массы нужно иметь набор соответствующих стандартов, на основании которых будет построена калибровочная кривая, отражающая зависимость Уе, или коэффициента распределения от lgЛI (см. табл. 35.1). Чтобы избежать ошибок, связанных с различным поведением линейных и глобулярных белков при ГПХ, при анализе глобулярных белков в качестве стандартов можно использовать только глобулярные белки. Определение молекулярной массы в широком диапазоне может быть проведено на колонке с агарозой в присутствии денатурирующих агентов [7]. Для определения молекулярной массы и разделения белков с М 10 —10 дальтон применяются гели сшитого декстрана, например сефадексы 0-75, 0-100, 0-150 и 0-200, и полиакриламидные гели, например биогели Р-30—Р-300. Более высокомолекулярные белки, с М 10 —10 дальтон, фракционируют на гелях агарозы типа сефароза 2В—6В или биогелях А-0,5—А-0,150. Подробные характеристики этих материалов приводятся в гл. 5. [c.425]

Гель-хроматография применяется, как уже указывалось, при обессиливании растворов (малые по размеру ионы солей проникаю в поры ге я и удерживаются там), для группового разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных органических соединений (например, глицериде в жирных кислот с молекулярной массой около 200—500), в анализе биологических объектов (часто с использованием буферных систем с целью предотвратить разрушение ферментоп), для определения молекулярной массы белков (в том числе содержащихся в сыворотке К]ювп, в спинн( -мозговой жидкости), углеводородов и др)гих вещеста. [c.285]

Число аминокислотных остатков, входяшд4Х в молекулы отдельных белков, весьма различно в инсулине их 51, в миоглобине - около 140. Поэтому и молекулярная масса белков колеблется в очень широких пределах - от 10 ООО до нескольких миллионов. На основе определения молекулярной массы и элементного анализа установлена эмпирическая формула белковой молекулы - гемоглобина крови [c.419]

Такая методика исследования применялась для определения молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот и для изучения их строения в адсорбционном слое этот метод позволяет получить ценные сведения о конформации молекул в поверхностном слое, поскольку эта последняя олределяет величину площади, занимаемую ими в двухмерной пленке. Чтобы преодолеть вазимное шритяжение молекул в адсорбционном слое, эти измерения проводят в той области значений pH, в которой молекулы заряжены вследствие ионизации. Электростатическое отталкивание несколько увеличивает эффективный размер молекул, но это влияние, как правило, невелико, и им пренебрегают. Более существенно заряд молекулы влияет на конформацию молекулы белка и площадь, занимаемую ею на поверхности. Соответственно конформация белка зависит от pH среды, так как величина pH определяет диссоциацию ионогенных групп и их гидратацию. При изменении pH изменяется и наклон прямых л5м(л) (см. рис. II—19), т. е. величина 51. [c.66]

Гель-фпльтрацию широко используют для определения молекулярных масс биополимеров, особенно белков. Чем меньше белок, тем больше объем элюции его с колонки (Fr) это, как мы видели,— основной закон гель-фильтрации. Графики селективности ясно указывают иа наличие линейной связи между логарифмом молекулярной массы белка (log М) и величиной Ка (или К ) в определенном интервале значений М для каждого типа геля. Казалось бы, задача этим решается. Достаточно определить в эксперименте значение для данного белка — и с помощью фирменного графика селективности можно будет найти log М, а следовательно, и М. Если довольствоваться весьма приближенным результатом, то можно так и поступить. Однако при более пристальном изучении этой проблемы с целью получить относптельно точные значения М она оказывается значительно слояшее. Прежде всего, фирменные графики селективности носят ориентировочный характер, и для разных партий одного и того же геля истинные зависимости log М от Кдч отличаются друг от друга. Это можно обойти, если построить самому такой график (калибровочную прямую) с помошью набора белков известной массы. Но тут-то и возникает главная трудность. Какие белки выбрать для такого построения Ответа на этот вопрос поищем сначала для случая нативньсх белков. [c.145]

Отсюда следует вывод, что определение молекулярной массы нативиых белков с помощью гель-фильтрации, даже проведенное на уровне описанного выше современного подхода к этой задаче, может дать лишь приближенный результат. Тем более это справедливо в случае весьма распространенного упрощенного способа использования калибровочных кривых, построенных по молекулярным массам маркерных белков без учета их формы. То же относится к определению гель-фильтрацией молекулярных масс нативных нуклеиновых кислот с помощью маркерных НК известной массы, когда в число таких маркеров тРНК включают наряду с рибосомаль-пыми РНК, а нередко и фрагментами ДНК. Говорить же серьезно [c.150]

Ввиду этого, прежде чем перейти к описанию определения методом гель-фильтрацпи молекулярных масс деиатурироваиных белков, имеет смысл в качестве иллюстрации кратко процитировать хотя бы три практически полезных примера определения молекулярной массы нативных белков и пептидов. [c.151]

Белев и соавторы для определения молекулярных масс денатурированных белков методом гель-фильтрацип использовали сефакрил S-200 Superfine . Колонку размером 1,6 х ЮО см калибровали четырьмя полипептидами с известным числом аминокислотных остатков N) — от 71 (токсин) до 579 (БСА). Элюцию вели 6 М водным раствором гуанидинхлорида (pH 5) со скоростью 3 мл/см -ч. Для точности объем элюента определяли по весу. График селектив- [c.153]

Анализ субъединиц глютенина с помощью электрофореза при кислых pH или двумерного электрофореза ДДС-ПААГ-ИЭФ или ДДС-ПААГ в формирующемся градиенте pH обнаруживает значительные различия их зарядов. Каждую полосу, наблюдаемую при одномерном электрофорезе и соответствующую определенной молекулярной массе, можно посредством электрофокусирования разделить на большое число белков, отличающихся своими изоэлектрическими точками. Так, по Данно и др. [57], субъединицы с предполагаемой молекулярной массой в пределах [c.208]

К наиболее распространенным физико-химическим методам определения молекулярной массы белков наряду с седиментационными относятся гель-хроматография (на колонках и в тонком слое), а также электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия. Использование этих методов не требует сложной аппаратуры и большого количества исследуемого материала. Получаемые результаты хорошо воспроизводятся и, как правило, коррелируют с данными, полученными другими методами. [c.116]

Одним из чрезвычайно интересных новых областей приложения масс-спектрометрии, которые активно изучается в настоящее время, является биохимия, или, точнее, определение параметров белков. Это является результатом внедрения таких методов, как MALDI и ионизации электрораспылением, которые обеспечивают экспрессное и точное определение средних молекулярных масс белков при малом количестве материала (на уровне пикомолей или ниже). Определяют среднюю молекулярную массу белка, так как для разделения различных изотопных пиков потребовалось бы спектральное разрешение по массе свыше 10000. В сравнении с другими, более традиционными биохимическими методами для определения молекулярной массы биологических макромолекул, такими, как SDS-PAGE и гель-проникающей хроматографии, масс-спектрометрия обеспечивает быстрое и легкое измерение, требующее малых количеств материала и обеспечивающее непревзойденную точность. Однако масс-спектрометрия является деструктивным методом, и использованный образец нельзя восстановить для последующих экспериментов. [c.307]

В случае измерения скорости седиментации необходимы поля центробежных сил, обеспечивающие полное осаждение белков. Белок, находящийся в виде коллоидного раствора, обладает большей плотностью, чем растворитель. В ходе центрифугирования на молекулу белка действует значительная центробежная сила, которая, вызывая движение молекулы через среду, обеспечивает скорость перемещения, пропорциональную трению молекулы в среде. Скорость седиментации прямо пропорциональна молекулярной массе. Для определения молекулярной массы необходимы приборы со скоростью вращения ротора до 60 тыс. об/мин. Раствором белка заполняют прозрачную ячейку. Изменения концентрации, возникающие в процессе центрифугирования, могут прослеживаться с помощью оптических методов, например посредством шлирен- или интерференционной оптики, а также посредством прямого измерения абсорбции в УФ-области (сканирующая система). [c.360]