ДНК вируса гриппа, клонирование

В середине 70-х годов было обнаружено, что геном вируса гриппа состоит из восьми отдельных сегментов РНК. Это послужило основой для многочисленных генетических исследований вируса. В отличие от изучения генетических систем других отрицательно-нитчатых вирусов, таких, как вирус везикулярного стоматита [199], у генетиков, занимающихся вирусом гриппа, почти нет проблем по установлению местоположения мутации, и в случае необходимости они могут определить точное изменение нуклеотидной последовательности [209]. Действительно, ясна линия действия по созданию сайт-специфических мутаций в отдельных генах вируса гриппа, клонированных в М13 [278], хотя есть еще проблемы с повторным введением подобных генов в систему вирус — клетка хозяина. [c.240]

Экспрессия клонированных генов вируса гриппа [c.161]

Клонирование в бактериальных плазмидах копий двухцепочечных ДНК различных сегментов РНК генома вируса гриппа дало возможность значительно расширить наше представление о белках вируса. Анализ последовательности ДНК клонированных генов в дополнение к известным из ранних классических экспериментов по химии белка данным позволил выяснить последовательности аминокислот всех известных кодируемых вирусом белков и обнаружить неизвестные до настояш его времени полипептиды сравнение первичных структур белков, кодируемых вирусами различных подтипов, углубили наше представление о механизмах антигенного дрейфа и шифта. Более того, знание последовательности аминокислот суш ественно упростило расшифровку трехмерных структур внешних областей гликопротеидов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) и позволило точно картировать антигенные сайты в структуре НА. [c.161]

Некоторым авторам удалось экспрессировать клонированные гены НА различных штаммов вируса гриппа в бактериях с использованием плазмид, содержащих либо la -, либо trp-промоторы [2, 3, 12]. Совсем недавно гены NS также были экспрессированы из промотора pL бактериофага ламбда [31]. Результаты этих экспериментов суммированы в табл. 12. [c.163]

Большинство (если даже не все) ДИ РНК являются по своему происхождению моногенными, а не полигенными. Это свидетельствует о том, что полимераза с прикрепленной возникающей цепью может не полностью открепиться от матрицы, а, возможно, подойти к новому сайту матрицы, который оказывается наложенным при образовании кратковременной вторичной структуры (или структур). Такие кратковременные вторичные структуры могут образовываться при репликации вследствие динамической природы взаимодействий РНК — белок. Хотя недавно было продемонстрировано наличие рекомбинации между молекулами РНК [38а], вовлечение подобного процесса зарождения ДИ РНК вируса гриппа происходит, очевидно, очень редко. Была предложена идея о возможном зарождении одной ДИ РНК, включающем сложные рекомбинационные события между генами РВ1 и РВ2, которая основывалась на полученных в результате клонирования рекомбинантной РНК данных [43]. [c.264]

При помощи клонированной ДНК были получены полные последовательности для сегментов РНК вируса B/Lee/40 — 7-го [12], 8-го [И], 4-го (39] и 6-го (94]. Опубликованные данные о терминальных последовательностях РНК вируса гриппа В представлены в табл. 30 и 31 и свидетельствуют о возможно большей разнородности по сравнению с уже рассмотренными терминальными последовательностями вирусов гриппа А. Это достаточно неожиданно в свете относительно слабой антигенной изменчивости вируса гриппа В по сравнению с вирусами гриппа А. [c.274]

Последние достижения в развитии новейших технологических приемов значительно расширили наши возможности в определении генетического строения и молекулярной структуры вирусов, а также выявлении сходства штаммов и идентификации различий между вариантами вирусов. Наиболее важные из этих методов — клонирование и определение последовательности нуклеиновых кислот, картирование РНК и пептидов, а также антигенный анализ белков с помощью моноклональных антител. Задача последней обзорной главы данной книги — обсуждение эпидемиологии вируса гриппа в свете применения этих новых методов. Особое внимание уделено оценке последних достижений и изучению вопросов эпидемиологии, которые могут быть успешно решены при использовании молекулярных методов. [c.313]

По существу для характеристики штаммов, циркулирующих среди животных, могут быть использованы те же методы, которые применяются нри изучении вирусов гриппа человека. Особо следует отметить олигонуклеотидное картирование РНК [14], изучение последовательностей РНК и клонированных генов [1, 18], картирование пептидов, изучение белков и РНК в геле [23, 49], а также серологические методы [52, 55], которые успешно применяли для дифференцировки вирусов гриппа животных. Однако-эти вирусы изучены в меньшей степени, чем штаммы, выделенные от людей. Это относится не только к сведениям о структуре вирусов, но также к эпидемиологическим особенностям животных штаммов, патогенезу и иммунному ответу инфицированных животных. Будущие исследования, несомненно, будут направлены на выяснение некоторых из этих вопросов. Представляется воз- [c.318]

Схема конструирования и клонирования ДНК вируса гриппа. [c.40]

Д. Синтез двунитчатой ДНК с РНК вируса гриппа, клонирование и определение нуклеотидных последовательностей [c.39]

Другая важная задача — выведение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все более важное значение приобретает селекция животных по резистентности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Пока результаты селекщш на устойчивость животных к различным заболеваниям невелики, но обнаде-живающи. В частности, созданы популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепаразитарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием вторжению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторжению возбудителей, равно как и их размножению, препятствуют в основном иммунная система организма и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентности у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх -мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх был вьщелен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, экспрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о трансляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Ведутся исследования в целях получения трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лакто-ферина в тканях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели резистентность против аденовируса Н5 (Ads) более высокую на 90 — 98% по сравнению с контрольными линиями клеток. Л. К. Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, к заражению вирусом лейкоза. [c.130]

Одним из примеров гена резистентности является ген Мх мыши. Этот ген, найденный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх -мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Этот ген был выделен, клонирован и использован, в частности, для получения траисгенных свиней, которые экспрессировали ген Мх на уровне РНК (Г. Брем и др., 1991). Однако пока не получено данных об экспрессии у трансгенных свиней Мх-протеина и доказательства резистентности траисгенных свиней к вирусу гриппа. [c.234]

В монографии рассмотрены генетика и молекулярные основы репродукции вируса ipnnna, его эволюция и эпидемиология. Описаны геном вируса гриппа, транскрипция генома и геномные РНК-сегменты. Представлены данные об антигенной вариации и мутантах вирусов гриппа, экспрессии клонированных генов, генетическом базисе вирулентности вируса. Освещены наиболее крупные пандемии XX века. [c.4]

Экспрессия клонированных генов вируса гриппа.— М.-Дж. Гетсинг, [c.7]

Ретроспективно можно сказать, что эти ранние наблюдения свидетельствовали о важности взаимодействия гемагглютинина с рецептором при установлении вирулентности и четко демонстрировали генетическую гетерогенность популяции вирусов гриппа, с которой работали в лаборатории. Формальные доказательства этого явления были впервые представлены А. Isaaks и М. Edney (42], которые использовали для клонирования лабораторных штаммов метод предельных разведенихг. Этот метод, предназначенный для [c.12]

Разработка метода бляшек для вирусов гриппа в клетках фибропластов куриного эмбриона ( EF) [111 117] позволила идентифицировать одношаговые мутанты и установить частоту реверсии [117]. Она привела также к подтверждению более ранних исследований по кросс-реактивации вируса, инактивированного УФ-луча-ми [4, 19, 32, 64J, и, что особенно ван<но, к основанию методов клонирования некоторых бляшкообразующих штаммов вируса 1111]. Позднее использование перевиваемых человеческих клеточных линий расширило перечень вирусов, для изучения которых можно было применять метод бляшек и готовить рекомбинанты, различающиеся по типу образующихся бляшек [121, 122]. Только значительно позднее было установлено, что загадочная неспособность вирусов гриппа образовывать бляшки обусловлена главным образом необходимостью обязательного расщепления вирусного НА эндогенными протеазами клетки хозяина, без чего невозможны инфицирование клетки и репликация вируса [67, 76]. Возможность применения только тех нескольких вирусов (в основном WSN и RWS — вариантов оригинального штамма WS), которые образовывали отчетливые бляшки, значительно ограничивала проведение генетических экспериментов. К настоящему времени установлено, что образование бляшек вирусом WSN, по крайней мере [c.15]

Антигенные варианты NA вируса гриппа А/Токуо/3/67 (H2N2) были селекщюнированы при проведении одного пассажа вируса в куриных эмбрионах в присутствии моноклональных антител к NA. Варианты были отобраны с частотой из клонированного [c.144]

Дефектные интерферирующие частицы (ДИ) вируса гриппа генерируются пассажами с высокой л1ножественностью заражения в пермиссивных клетках. Эти частицы интересны тем, что они облегчают установление персистентной инфекции в культурах клеток и могут, таким образом, вызывать латентность. Они содержат молекулы маленьких РНК, которые отсутствуют в инфекционном вирусе и генерируются предпочтительнее массовой внутренней делецией из трех генов Р [74, 75], хотя клонированная ДНК одной малой РНК оказывается составленной из нескольких сегментов по крайней мере двух генов полимеразы [27, 70]. [c.155]

Техника рекомбинантной ДНК открыла еще одну возможность в освоении пути экспрессии клонированных генов вируса гриппа в прокариотах и эукариотах. Эти исследования имели две основные цели 1) получение больших количеств чистых поверхносд -ных антигенов (НА и КА) применительно к проблеме их дальнейшего использования в качестве вакцин 2) изучение в клетках прокариотов и эукариотов биосинтеза, структуры и функции индивидуальных белков вируса гриппа дикого типа или мутантов. Поскольку эти белки в естественных условиях кодируются геномом минус-цепочечной РНК, ранее было невозможно управлять их первичными структурами путем направленных изменений кодирующих их последовательностей нуклеотидов. [c.161]

В настоящее время известны многие системы векторов для экспрессии генов эукариотов в клетках бактерий или млекопитающих [для обзора см. 9.17]. Векторы, которые использовались для экспрессии клонированных генов вируса гриппа, содержали в дополнение к последовательностям ДНК, необходимых для их репликации в клетках-хозяевах, контролирующие элементы, которые стимулировали эффективную транскрипцию экзогенных генов и трансляцию образующихся мРНК. [c.162]

Описанные ранее системы клеток эукариотов обеспечивают только-кратковременную экспрессию генов-спутников (passenger genes) либо потому, что клетки-хозяева погибают вследствие литической инфекции, либо потому, что химерные геномы только кратковременно присутствуют в клетках. Линии клеток, которые непрерывно экспрессируют индивидуальные клонированные гены вируса гриппа, могут обеспечивать более удобный источник белка. Более того, используя активность слияния НА, они могут привести к развитию систем для доставки экзогенных генов и белков к клеткам. И наконец, они открывают путь исследованиям в области регуляции цитотоксических Т-клеточных ответов на вирусспецифические поверхностные антигены. [c.177]

Обязательным условием генетических исследований является тщательная селекция подходящих систем вирус — клетка хозяина и выделение мутантов из однократно клонированного потомства вируса дикого типа [55]. В случае вируса гриппа эти требования нелегко удовлетворить по следующим причинам а) несмотря на то что множество различных типов клеток может функционировать в качестве хозяина для вируса гриппа, большинство комбинаций вирус — клетка приводит к усилению цикла абортивной репликации, и вирус не образует бляпгек б) высокие скорости мутабиль-ности и генетической изменчивости генома вируса гриппа поднимают особые вопросы по определению природы популяции вируса дикого типа. [c.188]

Недавно генетическую вариабельность РНК вируса гриппа PR8 исследовали путем анализа более чем 200 клонов, приготовленных в дериватах бактериофага М13 [59]. Гетерогенность последовательности в клонированной ДНК была представлена одним нуклеотидным различием на 3700 нуклеотидов (ЗХ10 ), но основные ошибки, обусловленные ферментами репликации ДНК, необходимыми для изготовления кДНК, возможно, были столь велики, что затеняли естественную изменчивость в популяции РНК-содержащих вирусов [79, 156]. [c.190]

Два подхода должны оказаться очень полезными в дальнейших исследованиях с использованием мутантов вируса гриппа. Во-первых, первичное повреждение у большого количества нетекущих мутантов с повреждениями в отдельном сегменте РНК генома вируса гриппа должно быть установлено при тщательном изучении каждой из установленных стадий репликационного цикла. Использование коров для сравнения in vitro активностей вирионной транскриптазы ts-мутанта и вируса дикого типа должно оказать существенную помощь в расшифровке данных по инкубации при ограничите.11ьной температуре [274]. Недавно разработанные методы, в которых используются клонированные копии индивидуальных сегментов РНК [264], могут быть применены для проведения более прямого анализа фенотипа РНК но сравнению с тем, чтО было возможно до настоящего времени. И наконец, применение метода двухмерного электрофореза в геле в сочетании с изоэлектрическим фокусированием или электрофорезом в неравновесном градиенте pH дает значительные преимущества в характеристике изменений фенотипа в клетках, инфицированных мутантным ви- [c.240]

Хотя ДИ частицы вируса гриппа впервые были выявлены около 30 лет назад [64, 65], детально их свойства изучены совсем недавно. Отдельные сообщения о свойствах ДИ частиц вируса гриппа и их геномах были представлены ранее [48, 50]. С этого момента с использованием техники клонирования и секвенирования ДНК были определены полные последовательности прогениторных генов (РВ1, РА и РВ2) и число ДИ РНК. Поэтому в настоящей главе основное внимание уделено анализу современных данных по структуре ДИ РНК и их связи с прогениторными генами. [c.249]

Малые сегменты РНК, похожие на ДИ РНК, присутствуют в большей части (если не во всех) образцов вируса гриппа и вирусном материале, использованном в лаборатории. Они обнаруживаются в вирусном материале, получаемом как на клеточной культуре из пляков, так и при клонировании, хотя и на низком уровне [35]. Несмотря на то что ДИ частицы и ДИ РНК обычно присутствуют во многих образцах вируса гриппа, механизм зарождения и эволюции ДИ РНК из их прогениторных РНК представляет собой сложное явление и до сих пор слабо освещен по ряду причин. [c.261]

ДИ частицы вируса гриппа, продуцируемые при высокой множественности заражения, содержат молекулы ДИ РНК, которые относятся к 5 —З типу и возникают из внутренних делеций одного из генов полимеразы. Они могут быть транскрибированы в поли (А)-содержащие комплементарные РНК, имеющие характеристики РНК стандартного вируса. Структура ДИ РНК вируса гриппа и их возможная функция (т. е. транскрипция) оказываются отличными от соответствующих характеристик 5 ДИ РНК, которые представляют большинство несегментированных минус-цепочечных ДИ РНК. Хотя клонирование ДНК и секвенирование помогло в расшифровке первичной структуры ряда ДИ РНК и их прогениторных генов, специфические этапы, вовлеченные в зарождение и эволюцию ДИ РНК вируса гриппа, а также механизм интерференции остаются еще во многом неразрешенными и будут являться предметом исследования на ближайшие годы. [c.269]

М. Krystal и соавт. [39] секвенировали клонированные кДНК-копии гена НА B/Lee/40. Полная последовательность НА была получена при помощи двух клонов, один из которых простирался от синтетического олигонуклеотида, использованного в качестве праймера при синтезе кДНК, до 1336 основных пар. Второй клон начинался с нуклеотида 483 и простирался до 5 -конца вирионной РНК, что облегчило определение полной последовательпости. Общая длина составляет 1882 нуклеотида. Первый АУГ начинается в нуклеотиде 34, и в случае трансляции последовательности с этого инициирующего кодона предсказан белок из 584 аминокислот. N-терминальная последовательность начинается аминокислотой 16 [102]. Последовательность с 3-й по 15-ю аминокислоту неполярна и предположительно является сигнальным пептидом, как и у вирусов гриппа А [1, 22]. [c.276]

Имеется единственное сообщ ение об аминокислотном строении NA вируса гриппа В [46]. Однако аминокислотная последовательность может быть предсказана на основании последовательности клонированной кДНК-копии вирусной или мессенджер-РНК [94]. Клонированная ДНК содержит 10 нуклеотидов, полученных от клеточной РНК за счет процесса переноса кэпа , который является общим для вирусов гриппа А и В [37]. [c.277]

Была определена полная нуклеотидная последовательность клонированной в полную длину ДНК-копии сегмента 7 РНК генома, кодирующего матричный белок вируса гриппа В/Ьее/40 [83]. Был получен клон от кДНК-копий вирусной РНК и мессенджер-РНК [12]. [c.279]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология