Пептиды картирование

В нативной форме. Существует также метод, называемый пептидным картированием или снятием отпечатков пальцев . При этом белки сначала обрабатываются трипсином или каким-либо другим ферментом, гидролизующим полипептидные цепи, а затем смесь сравнительно небольших молекул пептидов подвергается двумерной хроматографии или хроматографии в одном направлении и электрофорезу-в другом (рис. 22.13). Наиболее эффективным методом было бы, конечно, определение точной аминокислотной последовательности, но это в высшей степени трудоемкая работа. [c.98]

Метод пептидного картирования был также использован для сравнения белков NP и М у 16 штаммов вируса гриппа типа А человека и трех штаммов вируса гриппа типа А низших позвоночных. Применяя разделенные пептиды как таксономический критерий, все нуклеопротеиды можно сгруппировать в одну из двух основных моделей, хотя некоторое дополнительное различие пептидов суш ествовало в каждой группе NP. Не было обнаружено корреляции между группами NP и подтипами НА. Эти данные можно интерпретировать в пользу того, что произошла пересортировка среди различных штаммов вируса гриппа [28]. [c.116]

Последние достижения в развитии новейших технологических приемов значительно расширили наши возможности в определении генетического строения и молекулярной структуры вирусов, а также выявлении сходства штаммов и идентификации различий между вариантами вирусов. Наиболее важные из этих методов — клонирование и определение последовательности нуклеиновых кислот, картирование РНК и пептидов, а также антигенный анализ белков с помощью моноклональных антител. Задача последней обзорной главы данной книги — обсуждение эпидемиологии вируса гриппа в свете применения этих новых методов. Особое внимание уделено оценке последних достижений и изучению вопросов эпидемиологии, которые могут быть успешно решены при использовании молекулярных методов. [c.313]

По существу для характеристики штаммов, циркулирующих среди животных, могут быть использованы те же методы, которые применяются нри изучении вирусов гриппа человека. Особо следует отметить олигонуклеотидное картирование РНК [14], изучение последовательностей РНК и клонированных генов [1, 18], картирование пептидов, изучение белков и РНК в геле [23, 49], а также серологические методы [52, 55], которые успешно применяли для дифференцировки вирусов гриппа животных. Однако-эти вирусы изучены в меньшей степени, чем штаммы, выделенные от людей. Это относится не только к сведениям о структуре вирусов, но также к эпидемиологическим особенностям животных штаммов, патогенезу и иммунному ответу инфицированных животных. Будущие исследования, несомненно, будут направлены на выяснение некоторых из этих вопросов. Представляется воз- [c.318]

МОИ пептидов, полученных из другого белка. Этот метод извес-теи как картирование по Кливленду (по имени первого автора статьи, где он был описан) [12]. В ПААГ в присутствии ДСН могут быть разделены полипептиды с диапазоном молекулярных масс от 10 до 10 но наиболее достоверные результаты получаются при анализе белков с истинными молекулярными массами от 10" до 10 , поэтому для белков с молекулярной массой dO" метод обычно не применяется. [c.224]

Картирование пептидов на практике [c.226]

Двумерное картирование пептидов [c.231]

В нашей лаборатории методы ВЖХ используют для очистки и изучения структуры и функции иммуноглобулинов. Ниже приведены детальные описания применяемых вариантов ВЖХ и примеры их использования. ГП-ВЖХ применяют для разделения легких и тяжелых цепей антител после восстановления и ал-килирования. Этот метод используют также для очистки фрагментов антител после их химического расщепления. ОФ-ВЖХ применяют для пептидного картирования антител. Мы обсудим в этой главе способы улучшения разделения пептидов и повышения чувствительности их детектирования, а также новый вариант очистки моноклональных антител в мягких условиях с помощью ГА-ВЖХ. Этот метод имеет ряд преимуществ, которые помогут повысить чистоту препаратов моноклональных антител. [c.139]

Описанным методом удобно вводить метку в пептиды белкового гидролизата для их последующего картирования, например в двумерной системе ТСХ-электрофорез на пластинах, покрытых целлюлозой. Преимущество по сравнению с введением [c.247]

С ВЫСОКОЙ разрешающей способностью (например, двумерное картирование пептидов). [c.79]

Вторая часть доказательства коллинеарности между нуклеотидной последовательностью в ДНК и последовательностью аминокислот в белках включала в себя определение полной аминокислотной последовательности триптофансинтетазы и картирование пептидных фрагментов мутантных ферментов (гл. 2, разд. 3,2). Пептидные карты позволили идентифицировать дефектные пептиды и точно установить природу аминокислотных замещений в большом числе различных ауксотрр-фов по триптофану. Когда это было сделано, оказалось, что мутациям, локализованным очень близко друг к другу, соответствовали аминокислотные замещения в непосредственно (или очень близко) прилегающих друг к другу участках полипептидной цепи. [c.251]

В таком сжатом и выборочном обзоре можно только упомянуть о несомненно важном вкладе секвенирования (вначале белков, позднее РНК и ДНК) в процесс познания генома вируса гриппа и его продуктов, особенно НА. Эта основополагаюш ая информация позволила провести не только интрацистронное картирование мутантов НА при помощи анализа триптических пептидов [72], но и первоначальную идентификацию антигенных сайтов [72, 78, 113, 134] в связи с селективным использованием моноклональных антител (см. главы 2, 4 и 5). [c.20]

Пептидное картирование основано на сравнении физико-химических характеристик отдельных пептидов или их смесей, полученных в результате фрагментации белковой молекулы. Для фрагментации может быть использован любой, приводящий к воспроизводимым результатам метод — расщепление пептидных связей протеолитическими ферментами или химическими реагентами. Эффективность пептидного картирования в каждом конкретном случае определяется выбором оптимальных условий разделения и обнаружения смеси фрагментов и достоверной ин-терпретацис результатов. [c.223]

Опубликовано множество вариантов картирования пептидов в гелях. С помощью электрофореза в первичном геле можно разделить несколько белков, после чего из геля вырезают полоску, накладывают ее на другой гель, проводят ферментативный гидролиз, как описано выше, и вторично разделяют электрофоретически образовавшиеся фрагме1Еты. [c.230]

Нет сомнения в том, что картирование по Кливленду в дальнейшем будет развиваться и совершенствоваться. Уже сейчас, например, становятся общедоступными эксперименты, в которых на основе содержащихся в клетке в очень малом количестве мРНК получают кДНК, клонируют ее и определяют нуклеотидную последовательность. Поли- и моноклональные антитела к синтетическим пептидам из выведенной последовательности используют для идентификации соответствующих белков на элект-рофореграммах. [c.231]

Известно три варианта аналитического картирования пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) обращенно-фазовая (ОФ-ВЭЖХ), ионообменная и гель-пропикающая хроматография. [c.235]

РИС. 7.3. Разделение триптических пептидов актинов моллюска и кролика на пластинках с тонким слоем силикагеля G. Триптические пептиды актинов моллюска (а) и кролика (б) стрелками отмечены уникальные пептиды электрофорез, pH 3,5 хроматография хлороформ — метанол — аммиак (2 2 1) в и г — триптические пептиды актинов моллюска (е) и кролика (г) стрелками отмечены уникальные пептиды, стрелкой со звездочкой — различие в положении пятен электрофорез, pH 6,5 хроматография пропанол — аммиак (7 3). д — гидролизат актина кролика, протеолиз и картирование в присутствии ДСН е — тот же гидролизат в обычных условиях некоторые пятна (обведены кружком) менее интенсивны в присутствии ДСН, в то же время другие (стрелки) более отчетливы электрофорез, pH 3,5 хроматография пропанол — аммиак (7 3). Все образцы нанесены в количестве 1 нмоль в 2,5 мкл (табл. 7.1) [60]. (С разрешения A ademi Press.) [c.236]

В качестве практически осуществленного примера применения ОФ-ВЭЖХ для картирования пептидов можно привести сравнительный анализ молекул нормального и мутантных гемоглобинов [1, 62]. При исследовании р-цепей нескольких гемо-глобинов человека их триптические гидролизаты были разделены на колонке С18, уравновешенной аммонийацетатным буфе- [c.238]

Гель-проникающая ВЭЖХ. Третий метод — гель-пропикающая ВЭЖХ —реже используется для аналитического картирования пептидов [66] главным образом из-за отсутствия колонок этого типа, пригодных для разделения сложных смесей небольших пептидов (М< 5000). Одпако имеются колонки, на которых можно фракционировать пептиды большего размера и белки они применяются на стадиях очистки или обессоливания белков, [c.239]

До настоящего времени предложено несколько методов пептидного картирования. С-концевой пептид у-цепи фетального гемоглобина идентифицировали, сравнивая электрофореграммы триптических гидролизатов после повторного разделения (pH 6,5) в направлении, перпендикулярном первому, до и после удаления С-копцевых остатков Arg или Lys при помощи карбоксипептидазы В прямо на листе бумаги [63]. Теоретически после обработки карбоксипептидазой на диагонали должен быть только С-концевой пептид. Однако в случае у-цепи гемоглобина человека па диагонали оказались 3 пятна, а именно свободный Lys, дипептид Val-Lys (так как дипептиды очень медленно расщепляются карбоксипептидазой [46]) и ожидае- [c.484]

Из всех использованных методов пептидного картирования наиболее элегантным является метод диагонального электрофореза (ЭФ), основанный на отсутствии свободной карбоксиль-ной группы в амидированных белках. Перед ферментативным расщеплением амидируют карбоксильные группы боковых цепей и С-концевой аминокислоты. После гидролиза С-концевой фрагмент оказывается единственным, не имеющим свободного карбоксила. Его можно селективно идентифицировать, так как его ионный заряд, а следовательно, и электрофоретическая подвижность почти одинаковы при изменении pH в любую сто рону от pH 3,5 (р/С а-карбоксильной группы). Подвижности пептидов, содержащих свободную карбоксильную группу, увеличатся при подкислении раствора (рН<3,5). После двумерного ЭФ на диагонали электрофореграммы обнаруживается только С-концевой пептид. [c.485]

Ни один метод картирования не дает абсолютно воспроизводимых результатов, и дансильный метод не составляет исключения. Хотя в повторных опытах с дансилированными триптическими гидролизатами общая картина повторяется, детальное сопоставление возможно только при параллельном анализе изучаемых белков. Необходимым контролем служит хроматография смеси различных дансилированных триптических гидролизатов, с помощью которой можно выявлять хроматографические аномалии и идентифицировать химически различные пептиды. [c.93]

Эпитопные библиотеки на основе нитевидных фагов обеспечивают гораздо более эффективную и дешевую альтернативу химическому синтезу пептидов с целью картирования непрерывных эпитопов, связывающихся с МАЬ. С помощью фаговых библиотек можно картировать и прерывистые конформационные эпитопы (см. гл. 17), однако это обычно возможно только в том случае, когда известна трехмерная структура белка. [c.199]