Хромосомы радиоавтография

Метод радиоавтографии представляет собой способ регистрации радиоактивности, в основе которого лежит фотохимическая реакция. В последнее время в биохимических исследованиях радиоавтография все чаще становится естественным дополнением к другим методам обнаружения радиоактивности. Это объясняется следующим во-первых, с помощью метода радиоавтографии можно точно локализовать включение предшественника, меченого радиоактивными изотопами, в совершенно определенные компоненты данной ткани, возможно наблюдение перемещения метки. внутри тканевой системы некоторые изотопы дают возможность локализовать включение метаболита в отдельные компоненты клетки —ядро или цитоплазму, ядрышки, отдельные хромосомы и даже определенные участки хромосом. Во-вторых, с помощью этого метода возможна регистрация включения такого незначительного количества радиоактивных элементов, которое не может быть обнаружено обычными физическими приборами. В-третьих, радиоавтография дает возможность обнаруживать включение меченого предшест- [c.343]

Фиг. 99. Схематическое изображение хромосомы Е. соИ, представленной на радиоавтографе на фиг. 98.

B. Схематическое изображение распределения молекул ДНК в реплицирующихся хромосомах. Хотя при микроскопическом исследовании радиоавтографов отдельные цепи ДНК не видны, на схеме они изображены в виде линий, чтобы показать, что их распределение соответствует характеру включении метки ыа фото Л и Б. Пунктирные линии соответствуют меченым цепям, а сплошные линии — немеченым. Точки обозначают зерна на радиоавтографах. [c.500]

Фиг. 98. Радиоавтограф интактной хромосомы Е. oli, которую выращивали в присутствии Н-тимина в течение периода, несколько меньшего, чем два периода генерации.

В настоящее время для молекул ДНК известны три основные конформации и соответственно три основных способа репликации. Кольцевые молекулы ДНК, например реплицирующаяся форма ДНК фага лямбда, могут реплицироваться способом, обнаруженным на радиоавтографах хромосом Е. соИ. Репликация кольцевой молекулы ДНК начинается в определенной точке кольца и приводит к образованию вздутия , расширяющегося в двух направлениях вдоль хромосомы по мере репликации (рис. 4.22). Этот способ репликации ДНК ведет к образованию промежуточной структуры, напоминающей греческую букву 0. Тета-тип репликации превращает родительскую кольцевую хромосому в две дочерние кольцевые хромосомы, в каждой из которых сохраняется одна из цепей родительской молекулы ДНК, а вторая цепь заново синтезируется. [c.120]

Рис. 4.22. А. Радиоавтограф целой хромосомы Е. соН, меченной Н -тимидином.

Молекула ДНК обладает высоким отрицательным зарядом и, следовательно, в электрическом поле быстро движется к положительному электроду. При электрофорезе в полиакриламидном геле молекулы ДНК разделяются по размеру, так как меньшие молекулы легче и быстрее проходят через поры геля. Молекулы белка, связавшись с ДНК, вызывают уменьшение подвижности ее молекул в геле. Чем больше связавшийся белок, тем медленнее движется связанная с ним ДНК. Это явление лежит в основе метода, регистрирующего сдвиг подвижности в теле. С помощью этого метода удается обнаруживать даже следовые количества сайт-специфического ДНК-связывающего белка. Короткие фрагменты ДНК, длина и последовательность которых известна (полученные либо при клонировании ДНК, либо путем химического синтеза), метят радиоактивной меткой и смешивают с экстрактом клеток полученную смесь наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез Если фрагмент ДНК соответствует области хромосомы, с которой связываются многие сайт-специфические белки, то при радиоавтографии выявляется серия полос, обладающих разной подвижностью. Белки, связанные с ДНК в каждой из полос геля, можно отделить, фракционируя затем клеточные экстракты (рис. 9-9). [c.102]

Для того чтобы выявить транскрибируемые области на политенной хромосоме, можно ввести в клетки радиоактивный предшественник РНК [ Н]-уридин, а затем локализовать растущий транскрипт РНК с помощью радиоавтографии (рис. 9-47). Именно таким способом было установлено, что большая часть активного хроматина находится в де-конденсированном состоянии и образует характерные хромосомные пуфы. [c.126]

Каждая хромосома человека, по-видимому, состоит из одной молекулы ДНК, содержащей около 150 млн. нуклеотидов, поэтому для полной репликации такой молекулы с помощью одной репликационной вилки потребовалось бы 0,02-150-10 = 3 10 секунд, т.е. около 800 часов В действительности фаза 8 продолжается 8-10 часов. Не удивительно, что метод радиоавтографии [c.160]

Очевидно, репликация эукариотической ДНК, которая организована в нуклеосомы и находится в составе хроматиновых волокон, должна быть гораздо более сложной, чем репликация бактериальной хромосомы. Чтобы выяснить, как протекает репликация ДНК у эукариот, были проведены радиоавтографи-ческие эксперименты, аналогичные опытам Кэрнса по репликации Е. соИ. Эти эксперименты показали, что эукариотическая ДНК также реплицируется в двух направлениях, но репликативные вилки движутся очень медленно, раз в 10 медленней, чем у Е. соН. Если бы на каждую хромосому приходилась тол.ко одна пара репликативных вилок, то из-за 6ojtt-ших размеров эукариотических ДНК их репликация продолжалась бы почти два месяца. Оказалось, что репликация эукариотической ДНК начинается одновременно во многах точках (число которых, вероятно, превышает тысячу). Из каждой [c.898]

Образование РНК на ценях ДНК можно с успехом продемон- тpIipoвaть на гигантских хромосомах слюнных желез личинок СЫгопотиз. Некоторые участки этих хромосом могут очень сильно увеличиваться в размерах, образуя так называемые пуффы. При помощи радиоавтографии на них легко проследить образование РНК из предшественника — уридина, меченного тритием [180]. Исследование методом микроэлектрофореза дает возможность определять нуклеотидный состав РНК и ДНК (стр. 31) полученные результаты свидетельствуют о том, что образованная РНК представляет собой копию лишь одной цени ДНК [181]. Эта РНК, но-видимому, служит посредником в процессах передачи генетической информации (стр. 240) [205]. [c.235]

Затем проводят радиоавтографию, помещая фильтр на рентгеновскую пленку. Радиоактивное излучение от любой полосы, с которой связался зонд, засветит пленку (рис. 25.32). Многие мутации приводят к делениям в хромосоме, что в свою очередь вызывает уменьщение длины рестрикционного фрагмента. Такой фрагмент более подвижен в геле и при радиоавтографии дает свою отдельную полосу. Таким способом можно вьывить ген серповидноклеточной анемии. [c.260]

Двойной линией показаны две полинуклеотидные цепи ДНК хромосомной двойной спирали, прерывистыми линиями — цепи, не содержащие метки, сплошными — меченые цепи. За две генерации до выделения хромосомы (Og) полностью немеченная ДНК родительской клетки находилась в той же стадии на Vs завершенной репликации, как и ее внучатые ядра (2,0 g), показанные на фиг. 98. Допустим, что точка pi является точкой начала репликации, а Рг — точкой, в которой находится репликациоиная вилка. Спустя некоторое время (0,15 g) репликационная вилка передвинулась в точку рз после этого добавляли Н-тимин. и все вновь синтезированные цепи ДНК содержали метку Н. Спустя Ve времени генерации (0,3 g) репликации хромосомы завершалась, так как репликационная вилка достигала р,. Две дочерние хромосомы содержали наполовину меченные двойные спирали от Рз до pi, но были совершенно не мечены в остальной части. Проследим теперь судьбу одной из дочерних хромосом, в которой репликационная вилка достигла точки рз спустя Va времени генерации (1,0 g). На этой стадии участки А к Б. я также участок В от рз до pi содержали наполовину меченные двойные спирали сектор В от рз до Рз совершенно не содержал метки. Спустя /з времени генерации (1,3 g) репликационная Y-вилка снова достигла pi. Две внучатые хромосомы содержали полностью меченные двойные спирали от р, до pi и меченные наполовину в остальной части. Проследим теперь за двумя внучатыми хромосомами, в которых репликационная вилка достигла р, спустя Vs времени генерации (2,0 g), и в результате образовались хромосомы, по характеру распределения метки совершенно подобные той, которую удалось наблюдать на радиоавтографе, приведенном [c.204]

A. Радиоавтограф метафазной хромосомы ядра клетки корня бобов Vi ia faba, полученный спустя [c.500]

Результаты этого опыта представлены на фиг. 243 в виде двух микрофотографий ядер с метафазными хромосомами. В метафазных ядрах две сестринские хромосомы, возникшие в результате репликации ДНК в предыдущей интерфазе, расположены рядом друг с другом в таком виде они готовы разойтись к противоположным полюсам делящейся клетки в последующей анафазе (фиг. 6). Черные зерна, которые можно увидеть над сестринскими хромосомами, образовались в результате действия на фотоэмульсию электронов, выделяющихся при распаде радиоактивных атомов Н, включившихся в хромосомную ДНК. Поэтому плотность зерен над хромосомой пропорциональна количеству содержащихся в ней атомов Н. Как следует из радиоавтографа, приведенного на фиг. 243, две сестринские хромосомы, зафиксированные в конце периода включения метки, содержат молекулы ДНК, меченные в одинаковой степени, тогда как из двух сестринских хромосом, зафиксированных спустя одно деление после включения метки, одна содержит метку, а другая — нет. Схема внизу (фиг. 243) поясняет, что именно такое распределение метки соответствует полуконсервагивной репликации хромосомы, содержащей одну двуспиральную молекулу ДНК. [c.500]

Рис. 9-47. Синтез РНК на гигантской политенной хромосоме из слюнных желез насекомого hironomus tentans. На представленном радиоавтографе хромосомы, меченной [ Н]-уридином. области синтеза РНК покрыты темными гранулами серебра в соответствии с активностью

Как показывает радиоавтограф (фиг. 243, Б), полученный спустя один цикл репликации после включения метки, между двумя сестринскими хроматидами произошел реципрокный обмен ДНК- Видно, что, в тО) время как концевой участок одной из двух сестринских хромосом содержит метку, гомологичный участок второй хромосомы ее не содержит в следующем же участке вторая сестринская хромосома содержит, а первая не содержит метки. Такой обмен между сестринскими хромосомами можно легко объяснить механизмом обмена между дочерними цепями ДНК,, рассмотренным в гл. XV в связи с пострепликационной репарацией повреждений ДНК, возникающих при действии ультрафиолета на Е. oli. Как предполагал в 1963 г. Уайтхауз, после репликации молекулы ДНК родительской хромосомы в двух комплементарных дочерних цепях ДНК могут возникнуть одиночные разрывы, расположенные наискосок друг от друга (фиг. 244). Образовавшиеся при этом свободные концы затем удлиняются благодаря ограниченному синтезу, использующему в качестве матрицы родительские цепи ДНК. [c.501]

Под этим термином подразумевается совокупность подходов и методов, с помощью которых можно каждый ген отнести к определенной хромосоме, т.е. составить генетическую карту организма. Например, у человека благодаря применению двух основных методов—гибридизации соматических клеток и гибридизации in situ — установлена хромосомная локализация ряда генов, ответственных за некоторые заболевания. При гибридизации in situ препарат метафазных хромосом на поверхности стеклянной пластины инкубируют с радиоактивно меченным зондом. Точную область гибридизации определяют с помощью радиоавтографии (фотографическую эмульсию наносят, непосредственно на пластинку). Образование зерен над гистологически идентифицированной хромосомой позволяет сделать вывод о принадлежности данного гена к конкретной хромосоме, а часто и к определенному ее участку. Некоторые гены человека, локализованные методом гибридизации in situ, представлены в табл. 36.5. [c.46]

Где располагаются блоки сателлитной ДНК Развитие техники гибридизации нуклеиновых кислот позволило определить расположение последовательностей сателлитной ДНК непосредственно в хромосоме. При гибридизации in situ или цитологической гибридизации хромосомную ДНК денатурируют, обрабатывая клетки, распластанные на покровном стекле. Затем к препарату добавляют радиоактивный ДНК- или РНК-зонд. Зонд гибридизуется с комплементарными ему участками денатурированного генома. Расположение участков гибридизации можно определить с помощью радиоавтографии. [c.301]

Нативные молекулы ДНК очень велики и при экстракции из клеток обычно разрываются в результате физических или ферментативных воздействий. Мезелсон и Сталь в своих экспериментах по репликации ДНК Е. соН имели дело со сравнительно небольшими фрагментами ДНК, и полученные ими результаты относятся только к состоянию ДНК, предшествовавшему репликации и после нее. Полная репликация хромосомы Е. соН впервые наблюдалась Джоном Кейрнсом. Он разработал метод очень мягкого разрушения клеток Е. соИ. В результате Кейрнсу удалось вьщелить интактные хромосомы Е. соН и пометить их радиоактивным Н-тимидином. Меченые хромосомы аккуратно переносили из раствора на твердую поверхность, которая затем покрывалась в темноте фотографической эмульсией и в течение нескольких недель экспонировалась. В это время электроны, испускаемые радиоактивной ДНК, вызывали образование зерен серебра в фотоэмульсии вдоль молекул ДНК. Последующая обработка эмульсии дает радиоавтограф хромосомы, на котором цепочка зерен серебра отслеживает конформацию молекулы ДНК. Применение метода радиоавтографии привело прежде всего к установлению того факта, что ДНК Е. соН имеет кольцевую форму (рис. 4.22). Впоследствии было показано, что такую же форму имеет ДНК всех прокариотических организмов, а также вирусов и органелл эукариотических организмов. [c.120]

Крупные фаги Т2 и Т4 близкородственны. Они обладают идентичной организацией генома, и больщинство генов у них общие. Радиоавтография хромосомы фага Т4 (рис. 7.13) свидетельствует о линейности молекулы ДНК. Ее мол. масса равна 120-10 дальтон, а длина составляет 182 ООО пары нуклеотидов. Фаг Т4 был предметом интенсивных генети- [c.213]

Рнс. 7.7. Радиоавтографы хромосом человека (мужчины) (А) и шимпанзе (Б), демонстрирующие локализацию AT III РНК человека. У человека места скопления метки обнаруживаются главным образом в прицентромерном гетерохроматине хромосомы 9 стрелка) и Y-хромосоме стрелках небольшие скопления метки имеются и на некоторых других участках хромосом У шимпанзе большие количества AT А, сходство которой с AT III человека достаточно для образования гетеродуплексов, содержат около пяти пар хромосом [1938] [c.16]

Рис. 11-7. Метод, обычно используемый для измерения продолжительности фазы Сз- Асинхронно растущую клеточную популяцию короткое время выдерживают в присутствии Н-тимидина. После отмывки клеток от невключившегося меченого тимидина митотические клетки стряхивают через различные промежутки времени и находят минимальное время, когда радиоактивная ДНК уже появляется в делящихся клетках. Это время задержки равно продолжительности фазы 2. Вместо этого можно с помощью радиоавтографии определить время появления меченных тимидином ядер, которые содержат также конденсированные хромосомы. Если клетки находятся в ткани, применим только радиоавтографиче-ский метод.

Стекло покрывают фотоэмульсией и синтез ДНК выявляют методом радиоавтографии. Поскольку время инкубации с меченым тимидином выбирают так, чтобы репликационная вилка успела продвинуться вдоль ДНК на несколько микрометров, реплицированные участки ДНК видны под микроскопом как линии из зерен серебра, хотя сама ДНК остается невидимой (диаметр спирали ДНК 2 нм, а разрешающая способность светового микроскопа 200 нм). Результаты такого опыта представлены на рис. 1121, А темные следы реплицированной ДНК, длина которых увеличивается с удлинением периода включения Н-тимидина, показывают, что в хромосомах эукариот ре-пликационные вилки движутся со скоростью около 50 нуклеотидов в секунду. Эта скорость в 10 раз меньше, чем у бактерий, что, возможно, связано с большей трудностью репликации ДНК, упакованной в хроматин. [c.160]

Пунктирная линия изображает меченую субъединицу хромосомы, сплошная — немеченую. Точки — зерна засвеченной фотоэмульсии на радиоавтографе. I — удвоеиие в присутствии Н-тимидина, II — первая метафаза после включения метки, III — удвоение в отсутствие Н-тимидина, IV — вторая метафаза после включения метки [c.125]

Кольцевая структура генома. Оказалось, что различные штаммы Hfr переносят гены в клетки-реципиенты в неодинаковой последовательности. Сопоставление этих последовательностей показало, что все они согласуются с единой круговой генетической картой. Кольцевая структура генома Е. соИ была подтверждена в исследованиях Дж. Кэйрнса, получившего радиоавтографы ее реплицирующейся хромосомы (рис. 9.4). Единая кольцевая молекула генома Е. соИ содержит около 4000 тыс. п. н. Она может дополнительно включать F-фактор, имеющий кольцевую форму и состоящий из 60 тыс. п. н., а также другие плазмиды, профаги и иные необязательные элементы. [c.204]

Рис. 9-4. Строение рибосомной мини-хромосомы (А) и включение радиоактивно меченньк нуклеотидов ДНК-полимеразой Б) (задача 9-5). Рибосомные мини-хромосомы инкубировали в присутствии раз-личнш комбинаций нуклеотидов, ш указано, и затем обрабатывали ВатШ. Полученные фрагменты разделяли с помощью гель-электрофореза и выявляли методом радиоавтографии.

Вы изучаете транскрипцию на хромосомах типа ламповых щеток у тритона Тпшгиз, вводя Н-уридин в ооциты и определяя через равные промежутки времени радиоактивную РНК методом радиоавтографии. Сначала вы исследуете самые большие петли. Метка включается постепенно вдоль всей петли, как это показано на рис. 9-10. Процесс мечения всей петли занимает 14 сут. Проведя [c.137]

Смотреть страницы где упоминается термин Хромосомы радиоавтография: [c.215] [c.215] [c.104] [c.32] [c.234] [c.204] [c.315] [c.242] [c.128] [c.134] [c.68] [c.41] [c.104] [c.130] [c.166] [c.68] [c.104] [c.153] [c.301] [c.145]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология