Нуклеиновые кислоты рекомбинантные

США Берг П. Исследования молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (рекомбинантным ДНК) [c.542]

Выполнение фундаментальных исследований биохимии нуклеиновых кислот, особенно подробно -рекомбинантных ДИК [c.524]

Исследования биохимических свойств нуклеиновых кислот, в особенности рекомбинантных ДНК [c.776]

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (pH 13). При нагревании до 100 С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК ( плавлением ). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит [c.109]

Далее, необходимо было показать, что рекомбинантный химозин безопасен для применения. Компания представила данные, подтверждающие, что конечный препарат, экстрагированный из бактериальных телец включения и прошедший все необходимые этапы очистки, не загрязнен целыми бактериальными клетками, клеточным дебрисом и другими примесями, в том числе нуклеиновыми кислотами. Кроме того, многочисленные исследования показали, что штамм Е. со И К-12 нетоксичен и непатогенен для человека. Результаты тестирования на животных не выявили никаких побочных эффектов препарата, что свидетельствовало об отсутствии в нем токсинов. После изучения всей полученной информации FDA пришла к выводу, что рекомбинантный химозин может быть разрешен для коммерческого использования. [c.520]

За существенный вклад в установление первичной структуры ДНК За фундаментальные исследования биохимических свойств нуклеиновых кислот, в том числе рекомбинантных ДНК За вклад в развитие теории химических реакций [c.704]

Новейшим достижением в биотехнологии явилось создание технологии рекомбинантных ДНК, или генной инженерии. Эта область объединяет химию нуклеиновых кислот и белков, микробиологию, генетику и биохимию. Первой задачей генной инженерии является выделение и идентификация генетического материала (ДНК) из одного организма. Далее этот материал модифицируется с тем, чтобы его можно было ввести в новый организм-хозяин . При воспроизведении генетического материала хозяина введенная ДНК также воспроизводится. [c.117]

Ферменты играют огромную роль в развитии технологии рекомбинантной ДНК. Химическая трансформация ДНК, необходимая для целей генетической инженерии, не может быть обеспечена традиционными методами химии-нуклеиновых кислот, и поэтому масштабное внедрение методов генетической инженерии в значительной степени зависит от использования ферментов. Особую роль здесь играют ДНК-лигаза и эндонуклеазы рестрикции. Интерес представляет не только ферментативная модификация макромолекул, но также и ферментативный синтез олигонуклеотидов. [c.61]

Раздел IV описывает структуру и функции нуклеиновых кислот в рамках схемы ДНК РНК белок. В этот раздел включена новая глава о принципах технологии рекомбинантных ДНК, открывшей новые перспективы развития биомедицинской науки. [c.8]

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и анализируют с помощью авторадиографии с использованием чувствительной к радиоактивному излучению рентгеновской пленки. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения исследования идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот. [c.163]

В предыдущем разделе мы рассмотрели счет радиоактивно меченных нуклеиновых кислот. Однако мембранные фильтры играют и другую важную роль в исследовании нуклеиновых кислот благодаря их способности избирательно связывать эти макромолекулы. Мембраны из нитрата (но не ацетата) целлюлозы связывают денатурированную ДНК и гибриды РНК/ДНК, пропуская в то же время свободную РНК. Согласно данным фирмы Миллипор , нитроцеллюлозные мембраны связывают однонитевую ДНК в количестве 50—80 мкг/см , в то время как ацетилцеллюлозные мембраны связывают только 1 мкг/см . Благодаря такому селективному связыванию нитроцеллюлозные мембраны можно использовать при изучении гибридизации нуклеиновых кислот. В самом деле, это уникальное свойство нитроцеллюлозных мембран сыграло важную роль в исследованиях, ведущих к развитию технологии рекомбинантных ДНК. [c.319]

Методы переноса пятен. Мембраны из нитрата целлюлозы находят широкое применение в технологии рекомбинантных ДНК. Фрагменты нуклеиновые кислот, полученные обработкой [c.320]

В этой главе было описано использование мембранных фильтров в ряде отраслей биомедицины. Мы показали, что мембранные фильтры находят широкое применение в биомедицинских исследованиях как в своей обычной роли в качестве фильтрующих, так и в менее привычных ролях, а именно в качестве подложек при изучении белков и нуклеиновых кислот. Возможно, одна из наиболее широких областей применения мембранных фильтров связана с количественным определением радиоактивных веществ с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, хотя в некоторых случаях, оказывается, лучше использовать стекловолоконные фильтры. Важным достижением в области молекулярной биологии стало применение мембран из нитроцеллюлозы для гибридизации нуклеиновых кислот. Без разработки методов гибридизации с помощью мембранных фильтров было бы значительно задержано развитие технологии рекомбинантных ДНК. [c.331]

Огромное значение для молекулярной биологии последнего десятилетия имеет развитие генетической инженерии (возникшей в 1972—1973 гг. П. Берг, П. Лобан, С. Коэн и Г. Бойер) и методов работы с рекомбинантными ДНК в сочетании с методами химического синтеза крупных фрагментов ДНК. В результате сделались доступными для исследования индивидуальные гены и регуляторные генетические элементы, было стимулировано изучение ферментов биосинтеза и обмена нуклеиновых кислот. Благодаря этому после 1977 г. были обнаружены мозаичное (экзон-интронное) строение генов, явление сплайсинга и ферментативной активности у РНК, усилители ( энхансеры ) экспрессии генов, многие регуляторные белки, онкогены и онкобелки, мобильные генетические элементы. Возникла белковая инженерия, которая позволяет получать новые, не существующие в природе белки. Молекулярная биология начала оказывать существенное влияние на развитие биотехнологии, медицины и сельского хозяйства. [c.9]

Векторы на основе ДНК-содержанщх вирусов растений. Вирусы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеиновой кислоты, которые реплицируются и экспрессируются в клетках растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2 % вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержа-щим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов. [c.147]

Т4-полинуклеотидкиназа широко используется для фосфори-лирования олиго- и полинуклеотидов при работе с рекомбинантными ДНК, при химико-ферментативном синтезе нуклеиновых кислот и определении их последовательности. [c.353]

Быстрое распространение хроматографических и электрофоретических методов в области исследования нуклеиновых кислот, которому в значительной степени способствовало становление технологии рекомбинантных ДНК, продолжается и по сей день, особенно в таких направлениях, как разделение мРНК, фрагментов ДНК и нуклеопротеидов. Уже установлена первичная структура обширных участков генома многих животных, и непрерывное совершенствование метода гель-электрофореза, обладающего высоким разрешением, в сочетании с использованием компьютерной техники для определения полных нуклеотидных последовательностей позволит добиться еще более значительных успехов. На ранних этапах развития этой области исследований одна из задач экспериментатора заключалась в том, чтобы приспособить используемые в других областях науки хроматографические и электрофоретические методы для разделения моно- и олигонуклеотидов. Теперь же, по прошествии тридцати лет, биохимия нуклеиновых кислот сама стала тем источником новых представлений о разделении макромолекул, который стимулирует развитие хроматографии и электрофореза. [c.196]

Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать их организацию (блоттинг-гибридизация по Саузерну), строение мРНК (нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например, в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-гибридизации выделенной РНК (разд., 6.3). Более подробные качественные исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]). 5 - и З -концы транскриптов определяют, используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют установить только строение транскрибируемой области или гена, а также механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции. При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями, уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей, расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором расстоянии от 5 - и З -концов транскрибируемого-гена. Используя разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК, удается, модифгщировать клонированные гены и затем после введения мутантного гена-путем генетической трансформации обратно в растения анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные методики способствовали изучению нуклеотидных [c.307]

Результаты молекулярной гибридизации in situ могут быть достоверными только при условии высокой чистоты зондов поскольку метод основан на использовании избытка зонда, даже малейшие примеси могут принимать участие в гибридизации. Используя стандартные физические методы, можно получить зонды высокой чистоты для нуклеиновых кислот, имеющихся в избытке, таких как рибосомальная РНК. Однако относительно низкая концентрация большинства видов мРНК создает значительные трудности при использовании этих методов для получения зондов в чистом виде и в достаточном количестве. Проблема примесных последовательностей нуклеиновых кислот решается благодаря применению методов клонирования рекомбинантных ДНК в принципе эти методы могут быть использованы для получения зондов на любые интересующие вас гены или участки генома. [c.305]

Поскольку в экспериментальных условиях невозможно работать с одной копией гена, создание необходимого числа идентичных копий гена (или его частей) является первой и одной из основных задач генной инженерии. Для ее решения используют метод молекулярного клонирования [61]. Сущность метода заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицирующиеся молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами. Далее такая последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях, обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой чужеродной последовательности нуклеотидов. Объединение молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является не чем иным как рекомбинацией ш vitro, поэтому такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами. [c.39]

Бомбардировка клеток микрочастицами. Эта группа методов, иначе называемых баллистической (biolisti ) инъекцией, первоначально была разработана для введения рекомбинантных ДНК в клетки растений и в настоящее время приспособлена также для введения нуклеиновых кислот в клетки микроорганизмов, животных и человека как in vitro, так и in vivo [210, 216]. При этом подходе микрочастицы, содержащие ДНК, с помощью порохового заряда, сжатого гелия или электрического поля разгоняют до высоких скоростей ( 1000 м/сек) и поток частиц кратковременно направляют на поверхность клеток. Некоторые из ча- [c.151]

Предметом обсуждения в этой главе будет то воздействие, которое генетические методы, по-видимому, оказали на сенсорную технологию. В семидесятых годах, т. е. в течение последних десяти лет, в генетике было сделано четыре революционных открытия рестрикция ДНК эндонуклеазами, обнаружение плазмид (первоначально в бактериях), гибридизация нуклеиновых кислот, методы определения нуклеотидной последовательности ДНК. Благодаря этим открытиям стало возможным трансфеци-ровать в различные организмы, обычно бактериальные клетки, гены разного происхождения и затем экспрессировать их. Современное состояние техники получения рекомбинантных ДНК кратко описано ниже. [c.89]

В четырех главах, составляющих часть П, описаны приемы и методы конструирования, клонирования, отбора и получения характеристик рекомбинантных ДПК. Приведенный материал не может служить лабораторным руководством. Основной акцент делается лищь на рассмотрении ключевых положений. Часто обращается внимание на ранние результаты, благодаря которым был разработан тот или иной метод. Ученые, получивщие эти результаты, не могли предвидеть, как они скажутся на развитии технологии рекомбинантных ДПК. Теперь мы знаем, что именно успехи в молекулярной генетике прокариот и в изучении ферментов, осуществляющих синтез и деградацию нуклеиновых кислот, открыли путь к исследованию эукариотических геномов. [c.210]