Вирусы бляшки

Разработана специальная система, позволяющая избежать прерывания рамки считывания генов ВКО при встраивании чужеродного гена. При этом отпадает необходимость в использовании селективных маркеров, поскольку каждый образующий бляшку рекомбинантный вирус бу- [c.240]

Выявление по образованию бляшек. Бляшки вирусов представляют собой очаги разрушенных вирусом клеток монослоя под агаровым покрытием. Вирусные бляшки подсчитывают для количественного анализа инфекционной активности вирусов. [c.267]

Для получения бляшек разные разведения вирусной суспензии наносят на однослойные культуры ткани в плоских флаконах или чашках Петри и покрывают их слоем агарового покрытия. При этом репродукция вируса и ЦПД ограничиваются только первоначально инфицированными и соседними с ними клетками. Очаги клеточной дегенерации (бляшки) выявляют путем окрашивания культуры нейтральным красным, который либо включают в состав агарового покрытия, либо добавляют непосредственно перед учетом результатов. Бляшки состоят из погибших клеток, не окрашиваются нейтральным красным и поэтому выглядят в виде светлых пятен на фоне розово-красного монослоя. [c.267]

Выявление по изменению ХАО. При репродукции вирусов в куриных эмбрионах появляются характерные изменения на ХАО. Вирусы натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса на ХАО образуют бляшки — беловатые выпуклые пятна диаметром 1 — [c.268]

Рис. 4.1. Выявление вирусов по местным некрозам, зонам лизиса или стерильным пятнам. А. Местные некрозы, вызванные вирусом табачной мозаики на листе табака. Б. Зоны лизиса, возникшие в культуре ткани под действием вируса полиомиелита. В, Стерильные пятна, или бляшки , на бактериальном газоне — результат заражения бактериофагом.

После заражения культуры ткани вирусом он размножается внутри инфицированных клеток и распространяется на другие. Инфицированная клетка подвергается морфологическим и биохимическим изменениям и погибает. Этот процесс разрушения клеток в культуре известен как цитопатический эффект (ЦПЭ). Распространение вирусов от клетки к клетке может быть замедлено путем добавления слоя агары, в результате чего ЦПЭ будет ограничен небольшими областями, различимыми под микроскопом в виде так называемых бляшек в монослое клеток. Каждая бляшка обычно указывает иа отдельную инфицированную клетку, что можно связывать с отдельной инфицирующей вирусной единицей. [c.278]

Этот метод используется для количественного учета энтеровирусов в культурах ткани. Термин бляшкообразующая единица , или БОЕ, соогветствует наименьшей концентрации вирусов, которая образует 1 бляшку на монослое клеток. [c.279]

Поскольку в настоящее время уже выяснено, что неспособность многих штаммов вируса гриппа образовывать бляшки в клеточных культурах некоторых хозяев может быть преодолена путем добавления трипсина [14, 122], в будущем можно ожидать расширения круга систем вирус — клетка, используемых для генетических исследований. [c.188]

В основе метода лежит заражение небольшого числа клеток в полном монослое. Вирус, образующийся в зараженных клетках, распространяется вертикально, заражая соседние клетки известны различные способы предотвращения дальнейшего распространения вируса. Дегенеративный эффект вирусов на клетки распространяется до тех пор, пока не обнаруживается видимая область погибших клеток (бляшка). Окрашивание клеточного пласта позволяет легко визуализировать бесцветные бляшки. [c.204]

Очевидно, существует некоторая аналогия между развитием фиброза в тканях легких, пораженных силикозом, и развитием атеросклеротических бляшек в артериях. В обоих случаях наблюдаются потеря эластичности и аномальное быстрое разрастание тканей. Кроме того, происходит частичное омертвение ткани. Как отмечал Бендитт [296], клетки атеросклеротических бляшек, по прежним представлениям, считались фибробластами, но в настоящее время их идентифицируют как клетки, подобные клеткам гладкой мышечной ткани. Рост бляшки, по-види-мому, включает мутацию, которая ведет к быстрому размножению гладких мышечных клеток, что в свою очередь вызывает наращивание стенок артерий и приводит к омертвению ткани внутри массы самой атеросклеротической бляшки. Бендитт перечисляет возможные факторы, способствующие появлению мутации, такие, как химические мутагены, вирусы и ионизирующее излучение. [c.1064]

Рекомбинантный HSV можно получить и с помощью котрансфекции клеток-хозяев, в которых вирус может реплицироваться, с помощью ДНК HSV дикого типа и плазмиды, которая содержит терапевтический ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных участков HSV-генома. ДНК HSV дикого типа реплицируется в ядре клетки-хозя-ина, при этом в результате рекомбинации терапевтический ген может встроиться в HSV-re-ном. Затем частицы как рекомбинантного, так и дикого типа HSV упаковываются и высвобождаются из клеток. Доля рекомбинантных HSV в общем вирусном пуле очень мала, поэтому вирусы размножают, а затем с помощью ПЦР или гибридизации выявляют терапевтический ген в образовавшихся бляшках. Рекомбинантный вирус хранят в условиях, не допускающих его загрязнения HSV дикого типа (рис. 21.10). [c.498]

Время бляшкообразования под бентонитовым покрытием для различных вирусов неодинаково. Результаты образования бляшек для энтеровирусов, например, учитывают через 36 — 48 ч. Культуральные сосуды переворачивают монослоем вверх, смывая средой дегенерировавшие клетки. Бляшки, образуемые различными типами энтеровирусов, отличаются по величине, интенсивности развития и характеру краев. Поскольку одна вирусная инфекционная частица (вирион) образует одну бляшку, метод бляшкообразования позволяет точно определить количество инфекцио чных единиц в материале, а также измерить нейтрализующую активность вирусных антител. [c.268]

Существует косвенный метод подсчета вирусных частиц в образце, который позволяет определить массу каждой частицы. Этот подход особенно полезен в том случае, когда нет строгого соответствия между числом частиц и их способностью образовывать бляшки . Молекулярный вес вирусных частиц определяют методами седиментации — диффузии и светорассеяния. Умножив его на процентное содержание ДНК в вирусной частице, получают молекулярный вес ДНК. Среди методов, которые используются для определения содержания ДНК в вирусной частице, можно назвать определение фосфора (колориметрически или по величине радиоактивности P ) определение связанной с пуринами дезоксирибозы (колориметрическое) определение тимипа (но радиоактивности Н ) [16] опре-делепие ультрафиолетового поглощения (при этом допускается, что вклады ДНК и белка аддитивны) 1 109] и определение плавучей плотности ви-вируса (исходя из того же предположения). Общее содержание вируса в препарате можно определить по сухому весу, по инкременту показателя преломления [110] и исходя из суммарного содержания белка и нуклеиновой кислоты. [c.238]

Разработка метода бляшек для вирусов гриппа в клетках фибропластов куриного эмбриона ( EF) [111 117] позволила идентифицировать одношаговые мутанты и установить частоту реверсии [117]. Она привела также к подтверждению более ранних исследований по кросс-реактивации вируса, инактивированного УФ-луча-ми [4, 19, 32, 64J, и, что особенно ван<но, к основанию методов клонирования некоторых бляшкообразующих штаммов вируса 1111]. Позднее использование перевиваемых человеческих клеточных линий расширило перечень вирусов, для изучения которых можно было применять метод бляшек и готовить рекомбинанты, различающиеся по типу образующихся бляшек [121, 122]. Только значительно позднее было установлено, что загадочная неспособность вирусов гриппа образовывать бляшки обусловлена главным образом необходимостью обязательного расщепления вирусного НА эндогенными протеазами клетки хозяина, без чего невозможны инфицирование клетки и репликация вируса [67, 76]. Возможность применения только тех нескольких вирусов (в основном WSN и RWS — вариантов оригинального штамма WS), которые образовывали отчетливые бляшки, значительно ограничивала проведение генетических экспериментов. К настоящему времени установлено, что образование бляшек вирусом WSN, по крайней мере [c.15]

Для проведения полноценных генетических экспериментов необходимо, чтобы вирус был способен к бляшкообразованшо на используемых клетках хозяина. Это требование в значительной степени ограничило изучение ts-мутантов вируса гриппа использованием штамма WSN при инфицировании фибробластов куриного эмбриона [94, 141, 142, 248] или клеток MDBK [260, 261] рекомбинанта Х-3311 (на основе штамма NWS-A1, репродуцированного на хорион-аллантоисной мембране), образующего бляшки в клеточной линии человеческой конъюнктивы 1-5С-4 [271] птичьего вируса гриппа А (FPV), репродуцированного в фибробластах куриного эмбриона [9, 150, 222] некоторых человеческих вирусов — кандидатов в вакцинные штаммы, выращенных на первичных клетках почки цыпленка, обезьяны или быка [137, 159]. Совсем недавно в качестве хозяина для выращивания человеческих вакцинных штаммов были использованы также клетки MD K [117, 243, 244, 245]. [c.188]

Большинство выделенных ts-мутантов было производными намеренного мутагенеза [58, 248]. Эта процедура может давать большое число мутаций для каждого мутанта вируса гриппа. Вероятность многократных мутаций впоследствии возрастает за счет пассажей с бляшки на бляшку, проводимых в процессе приготовления пулов мутантов (254] селекция мутантов с низкой бляшкообразующей способностью при непермиссивной темнератзгре будет также способствовать селекции многократных мутантов [248]. Поэтому велика вероятность появления безмолвных мутаций в дополнение к ts-повреждениям в процессе исследования, и об этом необходимо [c.190]

J. Almond [4] выделял мутанты FPV методом увеличения бляшек или спонтанно (Sp-серии), выращиванием с 5-ФУ (mF- e-рии), обработкой вируса дикого типа 100 мкг/мл NTG (inN-серии) или 50 мкг/мл NTG (без обозначения). Он выделил также 5-ФУ-индуцированные мутанты путем сбора и исследования каждой бляшки (US-серии). Его результаты исследования 49 мутантов сводятся к следующему [c.193]

К фенотипическим особенностям вирусов гриппа относятся различия биологической активности в разных клеточных системах хозяина, включая различия в ареале хозяев, органоснецифично-сти и распространенности среди животных, а также в бляшко-образовании в разных культурах клеток. Разработаны надежные лабораторные методы, позволяющие определить происхождение отдельных сегментов РНК у реассортантных вирусов, возникших в естественных условиях или полученных в лаборатории. Это позволило получить ранее недоступную информацию о роли отдельных генов или их комбинаций в возникновении некоторых биологических различий, а также приступить к изучению ряда фундаментальных вопросов сложных молекулярных механизмов, [c.296]

Хотя из приведенных выше данных ясно, что чувствительность НА птичьих вирусов гриппа к расщеплению детерминирована их структурой, в других системах различия в вирусной NA могут обусловливать способность к расщеплению НА. Среди человеческих вирусов гриппа способностью претерпевать многоцикловую репликацию и образовывать бляшки в культуре клеток MDBK обладает только вирус гриппа A/WSN/33 (H1N1). Анализ реас- [c.299]

Рис. 14.2. Бляшки вируса простого герпеса на слое клеток ВНК/С13. Полный монослой клеток ВНК21/С13 Заражали препаратами вирус (тип 2) в различном разведении. Слеваколичество бляшек невелико, но в правой чаше бляшек много.

Более точным количественным методом учета от-дега>ных вирусных частиц является метод бляшек (рис. 33). Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубирования посевов в течение нескольких суток на агаровом покрытии появляются просветленные участки определенной формы (бляшки), представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое клеточной культуры. Каждая бляшка образуется при размножении одной вирусной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим методом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, морфология и сроки появ- [c.59]

Гидроксиламин является мощным мутагеном, который можно использовать для обработки in vitro ДНК или ДНК-содержащих вирусов. Достоинство этого соединения состоит в том, что известны его механизм действия и специфичность. Он вызывает исключительно транзиции G—vA. При правильном его применении получается очень высокое отношение мутаций к леталям. Поэтому им пользуются в тех случаях, когда возникает необходимость в сильном мутагенезе (например, при локализованном мутагенезе). Кроме того, следует иметь в виду, что тяжелый химический мутагенез часто приводит к образованию множественных мутаций. При работе с умеренными фагами степень мутагенеза удобно определять, выявляя среди выживших фагов мутантов, дающих прозрачные бляшки имеет смысл следить за количеством мутантов, образующих прозрачные бляшки, даже в экспериментах по локализованному мутагенезу, так как просто [c.74]

Некомплементирующий фаг часто способен вырасти при длительной инкубации и на бактериальных мутантах с неполным блоком. Тем не менее иногда комплементирующие вирусы MOiKHO отличить по тому, что образуются бляшки большего размера, или по тому, что они появляются раньше. [c.104]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология