Плавучая плотность, определение

Рис. 7. Графическое определение плавучей плотности вирусной частицы.

Существует несколько физических методов абсолютного измерения молекулярных масс, в первую очередь основанных на использовании седиментации или рэлеевского рассеяния света. Они требуют существенно большего количества индивидуального биополимера, чем описанные химические и биохимические методы, проводятся путем прецизионных измерений на дорогостоящем оборудовании и применительно к задаче измерения молекулярных масс белков и нуклеиновых кислот постепенно утрачивают свое значение. Седиментационные методы основаны на использовании уравнений (7.2) или (7.3). В первом случае измерению подлежат константа седиментации биополимера и коэффициент диффузии. Во втором случае нужно достичь состояния седиментационного равновесия и измерить распределение концентрации исследуемого биополимера вдоль центрифужной ячейки, т.е. концентрацию биополимера на нескольких разных расстояниях г от оси ротора. Оба метода требуют определения парциального удельного объема, или, что то же самое, плавучей плотности биополимера в условиях, используемых для седиментации. [c.267]

Для определения молярного содержания ГЦ (%) в ДНК чаще всего применяют два метода основанный на измерении плавучей плотности или анализе кривых температуры плавления (Тт) выделенных ДНК. В качестве стандарта в обоих случаях применяют ДНК известного состава, выделенную тем же методом. Оба метода быстрые и дешевые, хотя более точным является метод фракционирования ДНК на основания и количественное определение каждого нуклеотида в отдельности с использованием хроматографии на бумаге. Однако этот метод более длителен, трудоемок и для получения воспроизводимых результатов необходима тщательная очистка препарата ДНК от РНК- [c.143]

В центрифужной пробирке формируется градиент плотности СзС с наибольшей плотностью у дна пробирки. Если поместить В нее ДНК, то она сначала будет перемещаться по направлению ко дну пробирки, но затем в определенном положении остановится и будет держаться на плаву. В этом положении она не может ни всплыть, ни осесть, поскольку плотность раствора СзС здесь равна ее плотности. С помощью этого метода, более подробно описанного в гл. 28, можно отделить друг от друга молекулы ДНК, различающиеся по содержанию О С-пар, поскольку они обладают разной плавучей плотностью. Исходя из плавучей плотности данной ДНК, можно подсчитать соотношение в ней пар С С и А=Т. [c.867]

Правильность выделения специальной группы реовирусов стала очевидной, когда в начале 60-х гг. обнаружили уникальные особенности структуры реовирусной РНК. Сначала заметили, что при окрашивании клеток, зараженных реовирусами, акридиновым оранжевым наблюдается флуоресценция в зеленой области спектра (ортохроматическая), а не в оранжевой (мета-хроматическая), характерной для одноцепочечной РНК. Акридиновый оранжевый обладает высоким сродством к одноцепочечным нуклеиновым кислотам и окрашивает их метахроматически. Поскольку к тому времени уже было известно, что реовирусы содержат РНК, был сделан вывод, что эта РНК двухцепочечная [107]. Дальнейшие исследования показали, что реовирусная РНК состоит из комплементарных цепей, образующих двойную спираль [102, 157]. Для нее характерны высокая температура плавления и малый температурный интервал денатурации, устойчивость к панкреатической рибонуклеазе и иная, чем у одноцепочечной РНК, плавучая плотность. Определение нуклеотидного состава реовирусной РНК показало, что она содержит одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Двухцепочечный характер реовирусной РНК был подтвержден также данными рентгеноструктурного анализа [16, 102]. [c.266]

Существует несколько методов определения молярных процентов гуанина и цитозина (мол. % G + ) в ДНК, которые мы перечислим ниже 1) гидролиз и последующее разделение нуклеотидов или пуриновых ИЛИ пиримидиновых оснований 2) определение плавучей плотности 3) определение температуры плавления (денатурации) 4) бромирование [58] 5) апуринизация [37] 6) определение отношения Агео/Агао в буфере с низкой ионной силой при pH 3 [25] 7) жидкостная хроматография под высоким давлением нуклеотидов или свободных оснований [14,39]. Примесь РНК мешает определению всеми этими методами, за исключением методов, основанных на измерении плавучей плотности и температуры плавления Тт), поэтому последние стали наиболее популярными. [c.127]

Для определения нуклеотидного состава ДНК использовались и исследования физических характеристик двухцепочечных комплексов. Показано, что существует хорошая корреляция между температурой плавления или плавучей плотностью 2 таких комплексов и их нуклеотидным составом. [c.59]

При определении плавучей плотности ковалентно-замкнутой ДНК вируса полиомы (так называемой ДНК I) в градиенте плотности хлористого цезия с изменяющимся значением pH (щелочная область) наблюдается двухстадийный переход к денатурированному состоянию, характеризующемуся большей плавучей плотностью. Сопоставление этих результатов с аналогичными данными по изменению плавучей плотности той же самой ДНК, но с раз- [c.268]

Для определения плавучей плотности анализируемых частиц можно использовать центрифугирование в градиенте плотности. В этом случае после установления равновесия изучаемые частицы оказываются на том уровне, на котором их плотность и плотность раствора совпадают. Если плотность вещества несколько превышает единицу (например, для липопротеида, рч = = 1,02 г/мл), то его целесообразно сконцентрировать около мениска препаративным ультрацентрифугированием (не градиентным) в буферном растворе с плотностью, скажем, 1,15 г/мл, доведенной до такого значе- [c.180]

Различия в спектрах поглощения очищенных ДНК также могут быть использованы при определении их состава в сравнении с препаратом ДНК известного процентного содержания ГЦ. Этот метод дает быстрое и точное определение. Он считается удобной альтернативой, если оборудование для определения плавучей плотности или термальной денатурации ДНК недоступно. [c.143]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ СВЯЗЫВАНИЯ КРАСИТЕЛЯ ПО ВЕЛИЧИНЕ СДВИГА ПЛАВУЧЕЙ ПЛОТНОСТИ [c.402]

Во всех способах определения < р, обсуждавшихся выше, основной трудностью остается само измерение числа молекул красителя, связанных со сверхспиральной ДНК. Препараты многих сверхспиральных ДНК довольно трудно получить, а стандартные спектрофотометрические методы определения степени связывания (гл. 23) требуют больших количеств материала. Отличный от этого способ, впервые примененный Дж. Виноградом с сотрудниками, использует изменение (сдвиг) плавучей плотности ДНК при связывании ее с этидием. Плотность этидия меньше плотности нуклеиновых кислот, и к тому же он должен вытеснять противоионы Се " при своем связывании с ДНК. Самый прямой путь — это просто титровать ДНК этидием и определить ту точку, в которой открытая и замкнутая формы одной и той же ДНК имеют одинаковую плавучую плотность. Такой образ действий, однако, потребовал бы много трудоемких экспериментов. [c.402]

Использование значения плавучей плотности для определения относительного содержания нуклеиновой кислоты и белка в составе вирусных частиц может привести к ошибочным результатам за счет различий в связывании или проникновении ионов Сз+ в вирусные частицы, а также влияния используемой для центрифугирования среды на их гидратацию. [c.28]

Как отмечено в разд. 3.5, сведения об относительном содержании нуклеиновой кислоты и белка в составе вирусных частиц необходимы для того, чтобы непрямым методом рассчитывать их парциальный удельный объем. Использование для определения доли нуклеиновой кислоты спектров поглощения в ультрафиолете или плавучей плотности может приводить к неправильным результатам. Существует четыре метода определения содержания РНК, из них три прямых и один непрямой. Методы, описанные в разд. 4.3.1, 4.3.2 и 4.3.4, можно использовать и для определения содержания ДНК. [c.37]

Метризамид имеет определенные преимущества перед сахарозой в отношении плотности и вязкости его растворов. При одинаковой концентрации вязкость раствора метризамида несколько меньше, чем раствора сахарозы, а плотность — существенно выше. Это означает, что для создания устойчивых градиентов плотности растворов метризамида требуются заметно меньшие его концентрации. И все же метризамид практически почти не используют для зонально-скоростного центрифугирования, что объясняется рядом причин. Одна из них, как будет видно ниже,— очень низкие значения плавучих плотностей нуклеиновых кислот в его растворах и, следовательно, малые скорости осаждения [c.209]

С другой стороны, образование комплексов некоторых тяжелых металлов (Ag+, Hg +) с нуклеиновыми кислотами в определенных условиях носит избирательный характер и может быть использовано для создания различий в плавучей плотности разных типов нуклеиновых кислот. Этот и другие приемы целенаправленной модификации плавучей плотности нуклеиновых кислот (например, путем присоединения некоторых антибиотиков или красителей) будут рассмотрены ниже. [c.249]

НИЗКИЙ оптический дихроизм хлоропластов может объясняться именно этой недостаточно строгой ориентацией. Парк и др. [251—253] определили молекулярный состав квантосом, исследуя разрушенные хлоропласты шпината. Для зеленых ламеллярных структур диаметром от 2000 до 80 нм, полученных центрифугированием при постепенно возрастающих скоростях, отношение хлорофилла к азоту было довольно постоянным. Крупные структуры были, по-видимому, лишены гран, тогда как фракция более мелких частиц содержала граны. Эти результаты служат доказательством равномерного распределения хлорофилла по всей ламеллярной структуре хлоропласта. Было высказано предположение, что обычно наблюдаемая флуоресценция одних только гран объясняется более высоким содержанием ламеллярных структур. В квантосомах были обнаружены небольшие количества трех переходных металлов — железа, марганца и меди, причём концентрация марганца оказалась наиболее низкой. Марганец необходим для выделения кислорода при фотосинтезе. Учитывая это. Парк и Пон [253] рассчитали молекулярный вес наименьшей единицы в ламелле, которая, очевидно, еще могла бы осуществлять фотосинтез, т. е. частицы, соответствующей одному атому марганца. Он оказался равным 9,6-10 . Позже [251] расчеты были проведены с учетом данных об объеме квантосом (полученных путем измерений на электронных микрофотографиях), а также результатов определений эффективной плавучей плотности разрушенных ламеллярных структур в ультрацентрифуге. Было обнаружено, что молекулярный вес квантосом равен 2-10 , что соответствует двум атомам марганца. Данные о молекулярном составе квантосом представлены в табл. 1. Мембрана толщиной 10 нм содержит 50% липида и 50% белка. Следовательно, с учетом разницы в плотности (1,0 1,4) можно считать, что на долю липида приходится около 6,5 нм толщины мембраны, а это согласуется с представлением о существовании двойного липидного слоя. [c.35]

Однако в настоящее время установлено, что из-за наличия в некоторых ДНК определенных количеств минорных оснований не всегда существует четкая корреляция между данными по % ГЦ, вычисленными на основе кривых плавления и плавучей плотности (Garvie et al., 1974). По-видимому, если необходимо выявить незначительные различия в содержании ГЦ-пар изучаемых ДНК, нужно проводить сравнительные исследования этих ДНК при одних и тех же условиях каким-либо одним хорошо отработанным методом, но тем не менее с обязательным включением контрольной ДНК. До сих пор прямым и, по-видимому, наиболее точным является все же метод гидролиза ДНК до оснований (нуклеотидов) с последующим определением этих компонентов (Ванюшин, 1964). [c.12]

Для создания необходимых градиентов плотности в целях устранения конвекционных потоков или разделения частиц по их плавучей плотности можно использовать и некоторые другие вещества. Тяжелая вода для этой цели непригодна, так как, обмениваясь с молекулами воды гидратной оболочки частиц, она увеличивает их плотность. Имеются данные о применении градиентов плотности коллоидного раствора окиси тория, поливинил-пирролидона, солей цезия и рубидия, тартрата калия (для вирусов), бычьего сывороточного альбумина (для эритроцитов) [2]. В специальных случаях можно использовать сульфолан, триметилфосфат и мочевину [5] например, при исследовании рибосомной РНК, когда требуется, чтобы растворы были оптически прозрачны при 260 нм, или же когда фракцию приходится добавлять непосредственно в сцинтилляционную смесь, или в тех случаях, когда вещества, создающие градиент плотности, не должны искажать определения с орцинолом или дифениламином [5], Однако наиболее часто для увеличения плотности раствора по-прежнему используют растворы сахарозы и солей цезия. [c.176]

Методы определения и выделения замкнутых кольцевых двунитчатых ДНК основаны на их устойчивости к денатурации и изменении плавучей плотности в присутствии аминоакридинов [59, 60] или этидийбромида 35 [61, 62], который способен внедряться между парой [c.31]

Эффективность метода можно повысить, если для гибридизации использовать ДНК, обогащенную участками, комплементарными исследуемой РНК. Носледующее фракционирование можно нровести с помощью центрифугирования в градиенте нлотности. Предполагается, что полоса РНК-ДНК-гибрида с очень низким соотношением РНК/ДНК в градиенте плотности занимает характеристическое положепие [21, 40]. Обычно ее положение пе совпадает с положением основной массы ДНК. Поскольку количество РНК в гибриде не настолько велико, чтобы заметно влиять па плавучую плотность гибрида, смещение полосы происходит за счет того, что РНК выбирает определенные молекулы ДНК с плотностью, отличной от плотности основной масс1,1 ДНК. [c.168]

Благодаря простоте и хорошей воспроизводимости измерение плавучей плотности является стандартным методом определения состава и других характеристик нрепаратов ДНК (например, числа цепей, молекулярного веса и гомогенности) [7]. При сочетании этого метода с определением температурной зависимости поглощения ДНК в УФ-свете можно предсказать наличие в ДНК необычных компонентов (см. статью М. Манделя и Дж. Мармура, стр. 183). [c.175]

Определение истинного градиента плотности и абсолютного значения плавучей плотности ДНК. Для примера мы выбрали ДНК Е. соИ, образующей полосу при центрифугировании в градиенте S2SO4 при 31 410 об мин и 25° в течение 44 час. Чтобы точность и воспроизводимость результатов были максимальными, необходимо повторять калибровку при каждом изменении, вносимом в условия центрифугирования (нри изменении скорости, температуры, интервала плотности для каждой новой партии S2SO4, который может содержать различные примеси). [c.202]

Плавучую плотность ДНК определяли в лаборатории автора при 25 № л пп. или 31 410 об мип (СйгбО ). Точность определения составляла [c.206]

Существует косвенный метод подсчета вирусных частиц в образце, который позволяет определить массу каждой частицы. Этот подход особенно полезен в том случае, когда нет строгого соответствия между числом частиц и их способностью образовывать бляшки . Молекулярный вес вирусных частиц определяют методами седиментации — диффузии и светорассеяния. Умножив его на процентное содержание ДНК в вирусной частице, получают молекулярный вес ДНК. Среди методов, которые используются для определения содержания ДНК в вирусной частице, можно назвать определение фосфора (колориметрически или по величине радиоактивности P ) определение связанной с пуринами дезоксирибозы (колориметрическое) определение тимипа (но радиоактивности Н ) [16] опре-делепие ультрафиолетового поглощения (при этом допускается, что вклады ДНК и белка аддитивны) 1 109] и определение плавучей плотности ви-вируса (исходя из того же предположения). Общее содержание вируса в препарате можно определить по сухому весу, по инкременту показателя преломления [110] и исходя из суммарного содержания белка и нуклеиновой кислоты. [c.238]

Одно из свойств многих сателлитных ДНК-выраженная асимметрия в ориентации нуклеотидных пар двух цепей ДНК. В случае D. virilis (см. табл. 24.1) в каждой из основных фракций сателлитной ДНК одна цепь существенно богаче основаниями Т и О. Это увеличивает ее плавучую плотность, поэтому после денатурации тяжелая цепь (Н) может быть отделена от легкой цепи (Ь). Это может оказаться полезным при определении нуклеотидной последовательности сателлитной ДНК. [c.302]

Впервые корреляция между температурой плавления Тт) и составом оснований ДНК была описана Мармуром и Доти [45]. Мандель и др. [41] и ДеЛей [18] повторно исследовали эту корреляцию и также пришли к выводу о наличии связи между значениями Тт и плавучей плотности. Феррагут и Леклерк [23] сравнили методы определения Тт по кривым плавления. На значение Тт сильно влияет ионная сила используемого буфера, причем это характерно для всех препаратов ДНК. Следовательно, необходимо либо знать ионную силу применяемого буфера, либо использовать стандартный препарат ДНК, имеющий ту же ионную силу, что и неизвестные образцы. Последнее легко сделать следует просто диализовать все препараты ДНК (включая стандартную ДНК) в одной и той же партии буфера. [c.127]

Метод определения состава ДНК по плавучей плотности осно-ван на том, что если раствор ДНК подвергнуть высокоскоростному центрифугированию в градиенте плотности СзС1, то через определенное время она займет в градиенте место, соответствующее своей плавучей плотности. Значение плотности ДНК в середине пика, формируемого в центрифужной пробирке, называется плавучей плотностью ДНК. Она линейно зависит от молярного содержания ГЦ, %, Метод был впервые описан в 1962 г. и с тех пор не претерпел значительных модификаций. [c.145]

Для многих ДНК уравнение (22.31) не выполняется (см. рис. 22.21). Эти исключения весьма интересны. Синтетические ДНК с регулярными периодическими последовательностями имеют аномальную плавучую плотность, поскольку в них реализуются лишь вполне определенные типы взаимодействий между соседними парами. Значительные отклонения от уравнения (22.31) наблюдаются и для ДНК ряда бактериофагов. Это связано с наличием в таких ДНК необычных оснований, например 5-гидроксиметилцитозина, который замещает цитозин. Таким образом, измерение плавучей плотности является чувствительным методом выявления необычных составляющих в ДНК. [c.280]

Все рассмотренные выше способы определения стц предполагают, что нам известен угол, на который раскручивается ДНК при связывании с одной молекулой этидия. Мы уже упоминали, что первоначально полученная величина ф = —12° — это весьма грубая оценка, найденная с помощью построения пространственных моделей, которая согласовалась с результатами измерения угла раскручивания ДНК при щелочном тлтровании. В этих последних измерениях, однако, имелись некоторые трудности. За происходящими изменениями следили с помощью регистрации коэффициента седиментации или плавучей плотности, но в обоих случаях трудно было определить ту точку на кривой титрования, в которой происходит релаксация сверхвитков. Недавно Уонгу удалось более точно определить положение этой точки при этом он использовал молекулы с искусственно созданной сверхспирализацией, при титровании которых требовалось порядка 100 или более гидроксильных ионов на молекулу для снятия всех сверхвитков. Из сопоставления результатов измерений в щелочном градиенте плотности с результатами титрования этидием было получено новое значение Ф = —26°. При этом все предыдущие оценки числа сверхвитков изменяются приблизительно в два раза. [c.404]

Плавучая плотность частиц определенной химической природы может изменяться очень сильно. Например, плавучая плотт ность ДНК в воде составляет примерно 1,1 г/см , а в концентри- [c.176]

Определение плотности во фракциях сахарозного градиента (для водных растворов) можно производить путем измерения коэффициента преломления, пользуясь для расчетов следующей зависимостью ро=2,7329пго—2,6425. В этой формуле коэффициент преломления tho измеряют при 20 , а плотность раствора сахарозы рассчитывают для температуры 0°. Расчет плотности может оказаться необходимым для проверки линейности градиента или для определения плавучей плотности частиц. [c.222]

Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зснально-изопикнического, или рв -зонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность (рв), а не размеры или форма частиц (рис. 2.4). На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора (разд. 2.5.3) митохондрии, лизосомы, перок-сисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42 %-, 47%-, 47%-и 27%-НОЙ сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см"3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определен- [c.48]

Долгое время для определения нуклеотидного состава ДНК и РНК использовали разделение нуклеотидов, нуклеозидов или свободных азотистых оснований, полученных в результате деструкции исследуемых нуклеиновых кислот, при помощи хроматографических методов с последующим спектрофотометрическим анализом природы и содержания каждого из оснований. Однако в последнее время классические методы анализа нуклеотидного состава нуклеиновых кислот заменены физическими методами. Так, содержание ТЦ-пар в составе ДНК сейчас находят по температуре плавления ДНК и по ее плавучей плотности. В первом случае содержание ГЦ-пар связано с температурой плавления ДНК следующей зависимостью ГЦ (мол. %) = ( пл—69,3)-2,44. Эта зависимость справедлива, если ДНК растворена в стандартном солевом растворе (0,15 моль КаС1 и 0,015 моль цитрата натрия в 1 л, pH 7,0). Во втором случае содержание ГЦ-пар прямо пропорционально значению плавучей плотности ДНК, определяемой при ее ультрацентрифугировании в градиенте плотности С8С1. [c.202]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология