Гибридизация на мембранных фильтрах

Гибридизация на мембранных фильтрах [c.150]

Ф и г. 7. Конкурентная гибридизация на мембранных фильтрах [25]. [c.163]

Лучше всего удовлетворяет всем этим требованиям метод гибридизации на мембранных фильтрах (разд. I, Б, 4 и II, 1з, 3). [c.167]

Обработку монослоев белков, рибосом или нуклеиновых кислот, сорбированных на мембранных фильтрах, производят в основном так же, как и осадков (ТХУ- -спирт->-эфир). Подробнее такая обработка будет описана при рассмотрении методов гибридизации биополимеров на мембранных фильтрах. [c.216]

В той или иной форме мембранная фильтрация применяется уже почти 100 лет, однако лишь с конца 40-х гг. мембранные фильтры начинают выпускать в промышленных масштабах. Использовавшиеся вначале для бактериологических исследований воды мембраны постепенно начинают применять во многих других областях науки и техники. В 50-е гг. большим шагом вперед явилось использование мембран в биохимии, благодаря чему стало возможным широкое распространение радиоизотопной техники. В 60-е гг. появилось сообщение о первом применении мембран для гибридизации нуклеиновых кислот, а в конце 70-х гг. был разработан метод рекомбинации ДНК, что повлекло за собой широкое использование мембран в генном клонировании. [c.13]

ДЛЯ быстрого диагностирования индикаторов загрязнения и наличия патогенных организмов. В биохимии мембранные фильтры применяются в качестве пористых подложек при электрофорезе и для связывания нуклеиновых кислот при изучении гибридизации. Они широко используются в клинической практике, в том числе для установления наличия раковых клеток в ткани, при цитологических исследованиях тканевых жидкостей, для приготовления тех или иных лекарственных средств и т. п. В аналитической практике вещества, собранные на фильтре, можно подвергнуть рентгеноструктурному анализу, эмиссионной спектроскопии, микроскопии, гравиметрии или активационному анализу. Мембраны используются во многих аналитических приборах, например в газоанализаторах на кислород, в рН-метрах и электролитическом разделении ионов. В процессах диализа и ультрафильтрации используют по существу те же мембранные фильтры, но с другими размерами пор. Ныне один из самых тонких методов получения высококачественной воды, свободной от ионов, состоит в комбинировании микрофильтрации с обратным осмосом в последнем случае применяют более тонкопористые мембраны. [c.18]

В предыдущем разделе мы рассмотрели счет радиоактивно меченных нуклеиновых кислот. Однако мембранные фильтры играют и другую важную роль в исследовании нуклеиновых кислот благодаря их способности избирательно связывать эти макромолекулы. Мембраны из нитрата (но не ацетата) целлюлозы связывают денатурированную ДНК и гибриды РНК/ДНК, пропуская в то же время свободную РНК. Согласно данным фирмы Миллипор , нитроцеллюлозные мембраны связывают однонитевую ДНК в количестве 50—80 мкг/см , в то время как ацетилцеллюлозные мембраны связывают только 1 мкг/см . Благодаря такому селективному связыванию нитроцеллюлозные мембраны можно использовать при изучении гибридизации нуклеиновых кислот. В самом деле, это уникальное свойство нитроцеллюлозных мембран сыграло важную роль в исследованиях, ведущих к развитию технологии рекомбинантных ДНК. [c.319]

Рис. 11.12. Последовательность операций в методе гибридизации нуклеиновых кислот на мембранных фильтрах.

В этой главе было описано использование мембранных фильтров в ряде отраслей биомедицины. Мы показали, что мембранные фильтры находят широкое применение в биомедицинских исследованиях как в своей обычной роли в качестве фильтрующих, так и в менее привычных ролях, а именно в качестве подложек при изучении белков и нуклеиновых кислот. Возможно, одна из наиболее широких областей применения мембранных фильтров связана с количественным определением радиоактивных веществ с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, хотя в некоторых случаях, оказывается, лучше использовать стекловолоконные фильтры. Важным достижением в области молекулярной биологии стало применение мембран из нитроцеллюлозы для гибридизации нуклеиновых кислот. Без разработки методов гибридизации с помощью мембранных фильтров было бы значительно задержано развитие технологии рекомбинантных ДНК. [c.331]

Гибридизация РНК с ДНК в растворе по Гилешпи и Шпигельману. Образование гибридов происходит в жидкой фазе. После инкубации пробирки охлаждают и их содержимое собирают на мембранные фильтры. Последние промывают, обрабатывают РНК-азой, снова промывают, высушивают и Просчитывают их радиоактивность. [c.115]

Можно назвать множество примеров использования микрофильтрационных мембран в качестве фильтров для сбора частиц, подвергаемых затем анализу сбор бактерий для прямого подсчета с помощью микроскопа в прошедшем свете подсчет частиц в напитках подсчет фитопланктона измерение и подсчет инертных частиц подсчет асбестовых волокон, раковых клеток, адсорбция и элюирование вирусов и подсчет жизнеспособных водопереносимых бактерий [7]. Электрофорез является электрически управляемым процессом, в котором белковые фракции разделяются либо в микропористых ацетатцеллюлозных гелях [8], либо в ультрапористых агаровых или полиамидных гелях. Активному возбуждению гибридизации нуклеиновой кислоты помогает способность нитрата целлюлозы сильно сорбировать ДНК, поэтому и ДНК ДНК-, и ДНК РНК-гибриди-зации могут быть осуществлены на мембранном фильтре [7]. [c.85]

Таким образом, оптимальной телшературой для изучения гибридизации ДНК считается температура ниже температуры их плавления на 25°. А для того чтобы получить большую информацию о наличии строго комплементарных участков в молекулах изучаемых ДНК, можно применять более строгие условия эксперимента с температурой инкубации 75° (и даже 80° для организмов с высоким содержанием ГЦ-пар в их ДНК). Однако следует опасаться и другой крайности, так как, по мнению Пал-лерони и соавт. (Palleroni et al., 1972), в процессе гибридизации при высоких температурах происходят потери иммобилизованной на мембранных фильтрах ДНК, в связи с чем результаты получаются менее достоверные. [c.82]

Ионная сила. В опытах по гибридизации ДНК обычно используется раствор 2-SS (SSG — стандартный солевой раствор, содержащий 0,15 М Na l и 0,15 М нитрата натрия) пли 6-SS для лучшего связывания ДНК с мембранным фильтром. [c.83]

После иммобилизации мембранные фильтры промывают раствором 6SS , просушивают в течение 12 час. при комнатной температуре. Гибридизацию с мечеными фрагментами реперной ДНК проводят в бюксах при температуре инкубации, ниже температурн плавления ДНК на 25 , в течение 16—18 час. [c.133]

В настоящее время еще не разработаны методы для десорбции гибридов с мембранных фильтров. РНК из гибрида можно выделить, сначала разрушив связи, стабилизирующие гибрид (например, нагреванием при низкой концентрации солей или кратковременной обработкой 0,3 М КОН),. и затем элюируя РНК буфером 2XSS . В обоих случаях РНК может деградировать. Чтобы получить иптактные гибриды, гибридизацию следует проводить в растворе, а гибриды очищать центрифугированием в градиенте-плотности sGl или хроматографией на колонке с МАК (см. разд. V). [c.158]

ДНК и РНК выделены из Е. oli. Гибридизацию проводили па мембранных фильтрах (см. текст). Кривая I соответствует неочищенному препарату тРНК, кривая П — тому же препарату, из которого после предварительной гибридизации удалена деградированная рРНК. [c.161]

ДНК и РНК выделяли из Е. соН. Гибридизацию проводили на мембранном фильтре, используя избыток ДНК и небольшие количества РНК. После гибридизации в течение 24 час ДНК-фи. ц,тр удаля.чи и очищали образовавшийся гибрид. В раствор РНК помещали свежий ДНК-фильтр и повторя.г]и гибридизацию и очистку ибрида РПК гибридизовали со свежими порциями ДНК (на фильтрах) до тех пор, пока количество образующихся гибридов не стало постоянным (подряд на трех фильтрах). [c.164]

Предварительные результат .[ [14], полученньи нрп изучении, гибридизации синтетических дезокси- и рибоиоли нуклеотидов на мембранных фильтрах, показывают, что 1) полностью комплементарные нолинуклеоти- ды (иоли-У и ноли-дА) образуют толычо устойчивые к РНК-азе гибридь [c.165]

Гибридизацию между ДНК и фрагментами рРНК проводили на мембранных фильтрах при 44, 55 или 67°. После гибридизации фильтры помещали в свежий раствор буфера 2 X SS и инкубировали их при той же температуре в отсутствие РНК и в отсутствие РНК-азы (светлые значки) и в присутствии РНК-азы (темные значки). Изучали кинетику разрушении гибридов. [c.166]

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

Рис. 2. Отпечатки ДНК приготовлены с использованием одного фильтра в гибридизационных экспериментах с разными пробами. 5 мкг ДНК женщины и ее родителей были гидролизованы ферментом рестрикции Afbol и разделены на форезе в 1% ном агарозном геле при 2 В/см в течение 48 ч. ДНК перенесена из геля на найлоновую мембрану. Фильтр последовательно использовали для гибридизации с пробами 33.6, 33.15 и М13. На рисунках приведены радкоав-тографы гибридизационных экспериментов. Отмывка от гибридизационных проб проводилась по методике, описанной в разд. 4.4. Большое сходство картин отпечатков ДНК матери и отца объясняется их двоюродным родством.

Ннтроцеллюлрзные мембранные фильтры обладают способностью сорбировать щелочные белки. Этим можно воспользоваться для получения реплики . Фильтр накладывают на поверхность геля, и выходящие из него за счет диффузии белки тут же сорбируются и располагаются на нитроцеллюлозе точно такими же полосами, как и в геле. Далее уже на фильтре можно проводить идентификацию белков, например гибридизацией их с меченной Р ДНК [Bowen et al., 1980]. Простейшее устройство для этой цели, предложенное авторами цитируемой работы, [c.106]

В настоящее время перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры преследует обычно несколько иные цели, чем тогда, когда этот метод только разрабатывался. Так, в большинстве случаев перенос ДНК из геля на фильтры осуществляется для последующей визуализации полос ДНК с помощью нерадиоактивной колориметрической или хемилюминесцентной детекции, описанной выше в разделе 2.6, Причем вкупе с мультиплексным секвенированием возможно последовательное многократное проведение этапов молекулярной гибридизации с определенным зондом, несущим ту или иную метку визуализация Д1Ж зонда после ее гибридизации с ДНК, находящейся на фильтре удаление зонда и проведение аналогичных этапов со следующим зондом, С фрагментами ДНК, находящимися в полиакриламидном геле, проведение подобных процедур принципиально невозможно и поэтому перенос фрагментов ДНК из секвенирующего геля на мембранные фильтры занимает важное место в арсенале современной молекулярной биологии. [c.186]

Предложенный в 1984 г. метод геномного секвенирования был основан на выявлении определенных последовательностей ДНК путем их гибридизации с меченным зондом [ hur h, Gilbert, 1984]. Для осуществления такой гибридизации была необходима процедура переноса фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на нейлоновый фильтр. Перенос даже небольших фрагментов ДНК из полиакриламидного геля на мембранные фильтры за счет капиллярных сил малоэффективен и поэтому в данной работе, учитывая большие размеры геля, была сконструирована специальная камера для электропереноса. [c.186]

Следует отметить, что необходимым условием осуществления мультиплексного секвенирования ДНК является перенос фрагментов ДНК из полиакриламидного секвенирующего геля на мембранный фильтр, поскольку проведение всех этих последовательных процедур гибридизации, окрашивания, отмывки возможно только с мембранным фильтром. Второе условие заключается в прочной сорбции фрагментов ДНК на данном фильтре, выдерживающей многократные инкубации в различных растворах. В противном случае мультиплексное секвенирование будет просто невозможно. Немаловажное значение имеет тип используемой метки. Так, при использовании радиоактивной метки процесс выявления последовательностей всех матриц ДНК довольно продолжителен ввиду требующейся длительной экспозиции фильтра на рентгеновскую пленку, занимающей иногда несколько суток. Гораздо быстрее результаты могут быть получены с помощью хемилюминесценции такого субстрата, как 1,2-диоксетан. Считается, что каждый цикл мультиплексного секвенирования с его использованием требует 1 ч на гибридизацию с меченой пробой и 1,5 ч на все процедуры по выявлению гибридизационных сигналов [ reasey et al., 1991]. [c.299]

ИХ рестриктазами, разделяются электрофоретически на агарозе или полиакриламидном геле. Специфические фрагменты ДНК обнаруживаются затем путем гибридизации с помощью проб радиоактивно меченной нуклеиновой кислоты. Гибридизацию проводят после того, как фрагменты нуклеиновой кислоты будут физически перенесены с геля на мембранный фильтр (процедура, получивщая название перенос пятен , англ. blotting). Перенос производится таким образом, чтобы зафиксировать расположение пятен, которое было на геле. Это позволяет локализовать сегменты ДНК, комплементарные выбранной радиоактивной нуклеиновой кислоте (обычно РНК). Если для определенного белка радиоактивная РНК является информационной, то метод позволяет выделить ген этого белка. После идентификации гена его можно связать с соответствующим вектором клонирования и клонировать выращиванием в подходящем бактериальном штамме. [c.321]

Отсюда можно извлечь один урок. Нитроцеллюлозные мембраны, использованные для изучения гибридизации нуклеиновых кислот, были изобретены вовсе не для этой цели. Они долгие годы применялись для других целей и, к счастью, оказались доступными в тот момент, когда исследователи искали новые подходы к этой проблеме. Никакого систематического изучения мембран для гибридизации нуклеиновых кислот проведено не было. Возможно, существуют мембраны, которые лучше подходят для этой цели. К сожалению, выпуск мембранных фильтров — процесс настолько сложный, что исследователи, стремящиеся улучшить соответствующие методы, находятся в полной зависимости от производителей мембран. Вряд ли такое положение можно назвать удовлеворительным. Идеальный путь разработки новых методов состоит в том, чтобы исключить частнособственнические соображения. Торговые интересы должны вступать в силу лишь после того, как метод [c.331]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридизация на мембранных фильтрах: [c.72] [c.101] [c.104] [c.133] [c.149] [c.151] [c.151] [c.155] [c.159] [c.160] [c.162] [c.163] [c.169] [c.309] [c.188] [c.299] [c.302] [c.401] [c.404] [c.319]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология