Присоединение лигандов к активированным матрицам

Присоединение лигандов к активированным матрицам [c.63]

Присоединение белков и лигандов к активированной матрице осуществляется довольно просто (рис. 7). [c.72]

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрвдей лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, активированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз благодаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы [c.82]

При установлении констант равновесного связывания по данным хроматографии с зональным элюированием весьма важно, чтобы емкость колонки и сродство подвижного компонента к иммобилизованному лиганду соответствовали друг другу, только тогда можно получить в течение разумных промежутков времени вполне четкие кривые элюирования. Получение четких кривых элюирования зависит от ряда параметров, таких, как размер шариков и пор матрицы, диаметр и длина колонки и скорость потока [11, 12]. Кроме того, удерживание подвижного компонента непосредственно зависит от количества лиганда, присоединенного к матрице [1, 3]. При постоянной скорости потока и постоянном объеме колонки зоны подвижного компонента, введенного на матрицу с меньшим количеством иммобилизованного лиганда, элюируются в виде более острых пиков при меньших объемах элюирования. Увеличение количества иммобилизованного лиганда приводит к более широким пикам и большим объемам элюирования. Для установления соответствующей концентрации иммобилизованного лиганда для данной серии экспериментов обычно прибегают к методу проб и ошибок. Концентрация присоединенного к твердому носителю лиганда может первоначально контролироваться путем введения в реакцию с активированным твердым носителем определенных количеств лиганда. Дальнейшим исследованием ряда препаратов матрицы с различной плотностью лиганда можно опреде- [c.225]

БНФ-П<ефароза. В дополнение к лиганд-связывающей активности нейрофизинов (как описано выше), это семейство белков обладает также свойством самоассоциировать с образованием димеров из мономерных субъединиц. Это взаимодействие было изучено количественно методом аффинной хроматографии с использованием матрицы, представляющей собой бычий нейрофизин II (БНФ-П), присоединенный к сефарозе [4, 21, 22]. Сорбент БНФ-П-сефароза может быть получен в результате одностадийной реакции между NBr-активированной сефарозой и БНФ-П в 0,1 М бикарбонате натрия (pH 8,5), содержащем 0,5 моль/л хлорида натрия, при осторожном перемешивании в течение ночи при 4°С. Полученный гель промывают буфером для присоединения и перемешивают с 1,0 М этаноламином в том же буфере в течение 3 ч при комнатной температуре, затем промывают буфером для присоединения и 0,1 М ацетатом, содержащим 1 моль/л хлорида натрия (pH 3,5). Замещенная матрица для аналитического эксперимента, описанного в разд. 6.4, была получена взаимодействием 1 г активированной сефарозы с 5 мг БНФ-П и содержала по данным аминокислотного анализа 1,4 мг БНФ-П/мл упакованного геля. [c.229]

Во всех приведенных примерах реактивная группа активированной матрицы реагирует с нуклеофильным атомом азота в непротонп рованной аминогруппе. Для успешного протекания эти реакции приходится вести в более или менее щелочной среде. Недавно был предложен новый вариант активации матриц, несущих ОН-групиы (агароза, целлюлоза и др.), при котором образуется очень реактивная, так называемая трезилатная группировка (см. ниже). Присоединение лиганда идет с замещением всей этой группы в очень мягких [c.346]

При выборе спейсера, помимо длины, следует учесть степень его гидрофобности, поскольку от этого может зависеть неспецифпческая сорбция на матрице. Необходимо также выбрать химическую группу, которая окажется на свободном конце спейсера к этой группе должен присоединяться лиганд. Что касается присоединения спейсера к матрице, то здесь используются те же приемы, какие были описаны для присоединения лигандов к активированным матрицам, поэтому на ближайшем к матрице конце спейсера почти всегда располагается аминогруппа. [c.357]

Кроме того, СЫВг-активированные матрицы недостаточно устойчивы во времени поэтому реакция присоединения должна быть проведена немедленно после активации. Наблюдается довольно значительное отщепление присоединенного лиганда от СЫВг-активированных носителей, особенно в присутствии буферов, содержащих амины, но вопреки широко распространенному мнению можно использовать трис-буфер, так как аминогруппа триса стерически сильно экранирована. Например, трис не реагирует с нингидрином и с трудом ацилируется по аминогруппе в обычных условиях [1 [c.48]

Присоединение в трис-НС1 (pH 8,3) протекает со средней скоростью, но в итоге гель содержит столько же бора, сколько и в случае проведения конденсации в NaOH или фосфатном буфере. Следовательно, сам трис не реагирует с активированным гелем. Это может быть, кроме того, продемонстрировано отсутствием реакции после 18-часовой инкубации активированного геля в 2,0 М трисе при pH 10,0 и 60 X. На геле до и после обработки иммобилизуются равные количества алифатического диамина, и общее содержание азота в геле не меняется после инкубации. Было обнаружено, что родственное соединение, 2-амино-2-метил-1,3 Пропандиол, также не реагирует с триазинактивиро-ванными гелями. Структурные модели этих двух соединений указывают на то, что в наиболее стабильной форме атом азота стерически экранируется гидроксиметильными группами, которые могут сильно уменьшать его нуклеофильность. Для демонстрации этого факта можно показать, что ни один из этих двух аминов не реагирует с нингидрином с образованием синего продукта. По этим причинам вполне вероятно, что трис в равной степени не будет реагировать и с другими активированными матрицами различных типов и, таким образом, без всяких проблем может быть использован в буферах для присоединения лигандов. В действительности широко распространено мнение о нежелательности использования триса в растворах для присоединения лигандов, и очень часто трис рекомендуется в качестве удобного реагента для блокирования остающихся после иммобилизации лиганда активных групп. [c.172]

Присоединение лигандов к твердым носителям включает две стадии — активацию твердого носителя и присоединение лиганда к активированному носителю. В некоторых случаях включаются дополнительные стадии присоединения вставок различной длины к твердому носителю. Затем лиганды могут быть присоединены к свободному концу вставки. В целом стратегия иммобилизации обычно зависит от выбранного лиганда, доступности материалов (носитель и лиганд) и очевидной необходимости сохранения биоспецифичности и контролируемой емкости. В других отношениях химическая стратегия получения аффинных матриц для аналитических или препаративных целей по существу аналогична. [c.226]

Довольно высокая концентрация соли, которую рекомендуется вводить в буфер для связывания лиганда (0,5 М), нужна для блокирования неспецифической сорбции ионного характера, которая свойственна Br N-активированной агарозе. Напомним, что лиганд связывается с матрицей через остаток изомочевины, который относительно легко протонируется с появлением положительного заряда на присоединенном двойной связью атоме азота [S hnaar et al., 1977]. [c.377]

Если лиганды небольших размеров можно присоединять непосредственно к активированной сефарозе 4В, то крупным лигандам, таким, как белки, часто мешают при этом стерические препятствия, поэтому реакция между матрицей и лигандом протекает медленно и не до конца. Когда же белки вступают в реакцию, то вполне вероятно, что они образуют несколько ковалентных связей с матрицей. К сефарозе, активированной бромцианом, можно присоединить удлиняющие мостики , которые могут иметь на концах аминогруппы, карбоксильные, тиоловые и другие функциональные группы. Замещенную агарозную матрицу можно получить в лаборатории [36] или можно купить готовую агарозу с присоединенным к ней в качестве удлиняющего мостика алкиламином, конец которого связан с сукцинил-N- yK-цинимидным эфиром. Эта группа реагирует с алкил- или ариламинами. [c.217]

Большинство непротонированных первичных аминов (трис составляет исключение см. гл. 2, разд. 1.1) эффективно присоединяются к NBr-активированной агарозе и декстрану с образованием продуктов, структура которых показана на рис. 1. Образование N-замещенных производных изомочевины или иминокарбонатов зависит от используемого носителя. Присоединение должно проводиться при рН>р/Са лиганда (однако рН<Ю). Так, для ароматических аминов следует использовать pH 7 ч-8 (р а 5), для аминокислот pH 9,5ч-10 (p/(aa-NH2 8) и для алифатических аминов pH 10 (р/Са 9 10). В реакции присоединения не следует применять буферы, содержащие аминогруппы (при необходимости можно использовать трис [1]), так как аминогруппы буфера конкурируют с аминогруппами лиганда в реакции с активированными группами матрицы. В этих реакциях удобны боратные или [c.50]

К типичным гидрофобным адсорбентам, имеющимся в продаже, относятся адсорбенты, в состав которых входят линейные алифатические цепи, содержащие 4, 6, 8 и 10 атомов углерода (Р. Ь. В1осНеш1са18), а также адсорбенты с такими же цепями, но имеющими концевую аминогруппу (рис. 4.51,Л). Адсорбенты последнего типа предназначены преимущественно для присоединения аффинных лигандов, однако они сами по себе представляют интересные гидрофобные адсорбенты, в которых имеется группа, потенциально способная к образованию водородных связей и электростатическим взаимодействиям. Важно также отметить, что эти адсорбенты делаются на основе агарозы, активированной бромцианом, и поэтому содержат положительно заряженную группу на другом конце алифатической цепи (см, рис. 4.35). Доступны также фенилагарозы, в которых бензольное кольцо связано с матрицей через простые эфирные связи с глицерином (например, фенилсефароза рис. 4.51, ). [c.183]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология