Аффинные лиганды

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

В качестве аффинных лигандов для ферментов (а они, пожалуй, представляют наибольший практический интерес) могут выступать субстраты соответствующих ферментативных реакций и их аналоги, продукты этих реакций, ингибиторы и коферменты, аллостерические эффекторы, ионы металлов, а также специфические для каждого из ферментов антитела. [c.361]

Хотя синтез аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью при наличии одной из продажных активированных матриц и не представляет особого труда, он все же требует наличия достаточного количества очищенного аффинного лиганда, не инактивирующегося в условиях его посадки на матрицу. Заметим, что после посадки лиганда на матрицу прочность связывания с ним биоспецифического партнера может сильно уменьшиться по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при образовании их свободного комплекса в растворе (иной раз константа диссоциации комплекса на сорбенте может оказаться на три порядка выше, чем в растворе). Это обстоятельство играет важную роль при осуществлении конкурентной аффинной элюции вещества с сорбента с использованием свободного лиганда (см. ниже). Тем не менее прочность аффинного связывания в большинстве случаев оказывается достаточной для удержания нужного вещества на матрице в условиях отмывки с нее всех сопутствующих ему примесей. Нередко прочность комплекса вещества с аффинным лигандом увеличивается, если последний имеет некоторую свободу ориентирования в пространстве, т. е. закреплен на матрице с помощью спейсера. [c.362]

Этот кофермент участвует во множестве ферментативных реа к ций и имеет широкое поле применения в качестве аффинного лиганда с групповой специфичностью. Его закрепляют на матрице через [c.364]

Однако кажущаяся простота метода и отсутствие у новичка представления о возможных трудностях, сопровождающих его применение на практике, могут привести к обескураживающим неудачам. Действительно, трудно заранее предугадать, какой аффинный лиганд полезнее выбрать — с высоким или низким сродством, какова наиболее благоприятная концентрация этого лиганда в сорбенте, какую роль должна играть матрица, какие носители подходят и какие не подходят для иммобилизации аффинного лиганда. Например, отлично зарекомендовавшие себя с точки зрения иммобилизации ферментов носители на основе кремнезема оказываются в ряде случаев совершенно непригодными для использования в аффинной хроматографии из-за высокой неспецифической сорбции. [c.5]

Основной предпосылкой для проведения аффинной хроматографии является образование специфического комплекса ЕЬ между выделяемым ферментом Е и аффинным лигандом Ь, связанным с нерастворимым носителем. Применимы следующие уравнения [c.20]

Для того чтобы из уравнения (3.2) вывести другие зависимости, Грейвс и Ву [3] сделали следующие допущения. Объем геля V включает меньший объем V раствора внутри сетки, построенной полимерными молекулами геля. Перед добавлением раствора фермента концентрация аффинного лиганда, связанного в геле, равна 0 (в молях на объем и), а концентрация фермента равна [c.22]

Процент насыщения аффинного лиганда в различных условиях [c.26]

Как указывалось в гл. 2 (рис. 2.1), специфически сорбированный выделяемый фермент может быть освобожден из комплекса с пришитым аффинным лигандом либо при помощи раствора конкурентного ингибитора (биоспецифическое элюирование), либо при изменении среды. Последний метод является более общим как правило, меняют pH или ионную силу раствора. Хотя влияния таких изменений могут иметь сложный характер, Грейвс и Ву [3], выводя закономерности для освобождения фермента с аффинного [c.26]

Другим наиболее часто применяемым методом освобождения фермента из его комплекса со связанным лигандом является элюирование фермента раствором конкурентного ингибитора. При этом основное требование состоит в сохранении значения Кь в ходе процесса элюирования. Уравнения (3.1) и (3.2), описывающие равновесие между ферментом и связанным аффинным лигандом, необходимо дополнить [c.30]

Логически следует (и даже может быть доказано), что в присутствии двух ингибиторов, одного в растворе, а другого в виде иммобилизованного аффинного лиганда, в равновесии находится только небольшое количество свободного фермента [Е], хотя общее содержание фермента в растворе может быть значительным (в виде [Е1]). В большинстве случаев общее количество фермента в растворе можно без большой ошибки выразить как У [Е1] вместо У ([Е1]-)-[Е]). При таком упрощении, используя уравнение (3.25), а также введя p=V v, Грейвс и Ву вывели следующее уравнение для доли полученного фермента [c.31]

Лектинами называют белки или гликопротеиды растительного (фитогемагглютинины) или животного происхождения, проявляющие более или менее избирательное сродство к остаткам индивидуальных сахаров или групп сходных сахаров. Разнообразие остатков сахаров, часто встречающихся в природе, невелико, но они входят в салшх различных колхбинациях во множество биологически важных соединений полисахаридов, мукополисахаридов, гликопротеидов, глико-липидов и др. Многие из этих соединений участвуют в построении клеточных мембран. Подобно антителам, лектины обладают более чем одним участком связывания сахаров, что обусловливает их сио-собностъ агглютинировать эритроциты и другие клетки, отбирая их по классам, напрпмер опухолевые или эмбриональные. Используемые в качестве аффинных лигандов, лектины позволяют решать важные задачи очистки содержащих сахара компонентов плазмы, гликопротеидов клеточных мембран и др. [c.363]

Аффинный лиганд Хроматогра- фия Кинетика Кь, моль/л [c.47]

ДРУГИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АФФИННЫМИ ЛИГАНДАМИ [c.58]

Различия между Л01 и ДОь обусловлены изменением стерической доступности аффинного лиганда после его иммобилизации, его модификацией при связывании с носителем, природой нерастворимой матрицы и т. п. [c.64]

Влияние пористости геля на доступность иммобилизованного аффинного лиганда, необходимую для комплексообразования с комплементарной макромолекулой, показано на рис. 5.2. Лоу и Дин [18] изучили влияние степени пористости матрицы сефадекса [c.64]

Высокомолекулярные аффинные лиганды обычно открывают больше возможностей для приготовления аффинных сорбентов. Ряд очень активных аффинных сорбентов получен при прямом присоединении белка к нерастворимому носителю (многочисленные примеры приведены в гл. 11, табл. 11.1). Однако в этом случае очень важным является условие, чтобы присоединение белка к нерастворимому носителю не приводило к изменению его нативной конформации. [c.74]

Рис. 5.7. Влияние распределения аффинного лиганда на емкость 1 -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозы по лактатдегидрогеназе [6].

ВЫСОКОЙ концентрацией аффинного лиганда является слишком сильное взаимодействие с выделяемым вешеством, что затрудняет его элюирование. Так, например, тщательный контроль концентрации лиганда имеет решающее значение для выделения глюкокиназы на агарозе со связанной N-(6-аминогексил)-2-амино-2-дез-оксн-D-глюкопиранозой [14] (рис. 5.6). [c.81]

В отличпе от сефадексов и обычной сефарозы, пористость сшитой сефарозы практически не лсеняется при переходе от водных растворителей к органическим. При этом она устойчива к пх воздействию, что облегчает проведение разнообразных химических реакций замещения с целью получения аффинных сорбентов. Вместе с тем отметим, что активация сефарозы L бромистым цианом (для присоединения аффинных лигандов) происходит с вдвое более низкой эффективностью, чем в случае обычной сефарозы. Это объясняется тем, что сшивка идет по тем же самым гидроксилам, что и активация с помощью Br N. [c.120]

В аффинной — на биоспецифическом взаимодействии компонентов с аффинным лигандом, ковалентно связанным с нерастворимым носителем. Лигандами могут выступать, например, ингибиторы, кофакторы, субстраты, а носителями — силикаты, полиалкиламиды, декстрины, целлюлоза, хитин, крахмал. [c.9]

Аффиная хроматография является самостоятельной областью жидкостно-адсорбционной хроматографии, выделяемой по специфическому механизму взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом. Метод основан на характерной особенности биологически активньгх веществ селективно и обратимо связывать определенные вещества, называемые аффинными лигандами или аффиантами. Таким образом, ферменты связывают соответствующие ингибиторы, антитела — антигены, гормоны — их рецепторы и т.п. Если по аналогии с обращенными фазами приготовить сорбенты с привитыми аффинными лигандами, появляется возможность селективного хроматографического выделения близких по свойствам биологически активных соединений и их разделения между собой. Наиболее часто применяемые аффинные лиганды приведены в табл. 3.65. [c.201]

Элюирование из колонки в аффинной хроматографии может вызываться каким-либо растворимым аффиантом, образующим более прочное соединение с выделяемым веществом, чем привитые аффинные лиганды, изменением ионной силы раствора или температуры. В наиболее общем случае элюирование достигается путем изменения pH раствора, приводящего к подавлению диссоциации функциональных групп, ответственных за образование химической связи между сорбатом и сорбентом. Учитывая селективность сорбции, разделение в аффинной хроматографии часто реализуется по простейшей схеме динамической сорбции 1юглощение целевого биологически активного вещества на колонке с удалением в фильтрат несорбируе-мых примесей и его последующее элюирование в виде единственного хроматографического пика. Подобная схема оказывается наиболее удобной при решении препаративных задач. [c.201]

Узнавание основывается на взаимодействии нескольких центров биополимера со специфичным лигандом. Тем не менее в большинстве случаев в лиганде могут быть найдены некоторые центры, которые либо вообще ие участвуют в образовании комплекса, либо их изменение существенно не влияет иа стабильность комплекса. Эти центры могут быть использованы для присоединения реакционно-способных остатков к лигандам без существенного изменения способности образовывать комплекс с биополимером.. Внутри такого комплекса реакционно-способная группировка может оказаться сближенной с определенным остатком биополимера и в дгшьнейшем ковалентно связаться с реагентом. Следовательно, химическая модификация происходит либо в сайте узнавания, либо в близлежащей области биополимера. Так как эта реакция протекает вследствие сродства (аффинности) лиганда к биополимеру, то этот процесс называют аффинной модификацией. Процесс позволяет ввести радиоактивные, флуоресцентные, парамагнитные и другие метки в определенную область биополимера. [c.329]

Аффинная хроматография (или, более точно, биоаффинная или биоспецифическая по сродству хроматография) основана на исключительной способности биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества, называемые в общем случае лигандами или аффинными лигандами [16], или упрощенно аффинантами [19]. [c.15]

Хотя многие выведенные соотношения должны быть уточнены экспериментально, они уже сегодня полезны, поскольку указывают на аспекты, требующие от исследователя внимания. Аффинный сорбент с концентрацией связанного лиганда —Ю ммоль/л следует использовать только для выделения веществ, константы равновесия которых (с закрепленным аффинантом) 10 моль/л. Для систем с более высокими (менее благоприятными) константами равновесия следует использовать сорбенты с соответственно более высоким содержанием связанного аффинного лиганда. Однако на практике этому случаю сопутствуют многочисленные ограничения, которые рассматриваются в гл. 5. [c.34]

Объем элюирования макромолекулярного вещества прямо пропорционален концентрации аффинного лиганда, связанного с нерастворимым носителем, если концентрация растворимого аффинного лиганда постоянна. Кроме того, он обратно пропорционален концентрации растворимого аффинанта, если концентрация иммобилизованного аффинанта постоянна. Эти зависимости выражаются уравнением [c.45]

Константа диссоциации комплекса аффинного лиганда со стафилококковой нуклеазой (pH 7,5, в присутствии 10 мМ СаС12) [c.47]

МНг-сфероне проводилась в оптимальных условиях, взятых из данных, приведенных на рис. 3.1. Для элюирования использовались растворы антилпзина в различных концентрациях. Концентрация иммобилизованного аффинного лиганда [L], определенная исходя из эффективной емкости колонки, составила 2,6-10 моль/л. Свободный объем V-m, найденный с помощью декстрана 2000, равен 2,1 мл. Константа диссоциации комплекса химотрипсина с [c.50]

Конечно, встречаются случаи, когда пористость геля никак не влияет на взаимодействие макромолекул с иммобилизованным аффинантом это системы с высоким сродством или с предельно крупными макромолекулами, когда только аффинные лиганды, иммобилизованные на поверхности гранул носителя, принимают [c.67]

Однако для достижения хорошей доступности иммобилизованных аффинных лигандов и связываюшнх центров биологических макромолекул даже высокая пористость нерастворимого носителя не достаточна. Химические группы аффинанта, принимающие участие во взаимодействии с макромолекулярным веществом, также должны быть достаточно удалены от поверхности нерастворимой матрицы, чтобы не возникало стерических затруднений. [c.68]

Таким образом, чем сильнее взаимодействие субстрата и ингибитора с ферментом, тем выше комплементарность связываю-ших участков. Это справедливо не только в отношении пространственного расположения, но также и в отношении природы комп-лементирующих частей молекул. Однако способы привязки аффинного лиганда к нерастворимому носителю в значительной степени ограничены, потому что лиганд должен быть привязан той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании. Кроме того, иммобилизация аффинанта не должна приводить к изменению его конформации или отрицательно влиять на природу его связывающих участков. Эффективность аффинного сорбента зависит от степени, до которой эти требования выполняются. [c.73]

Теоретически выведенная взаимосвязь между количеством сорбируемого фермента, концентрацией аффинного лиганда и константами равновесия лиганд — фермент рассмотрена в гл. 3. Из рис. 3.3 следует, что для систем с низким сродством Кь = = 10 2 моль/л) концентрация привязанного аффинного лиганда представляет собой критический параметр для получения эффективного сорбента. На рис. 5.6 показана аффинная хроматография глюкокиназы на 2-амино-2-дезокси-о-глюкопиранозо-N-(6-амино-гексаноил) —сефарозе при четырех концентрациях связанного аффинанта [15]. Видно, что оптимальная концентрация аффинного лиганда равна 3,75 мкмоль/г (рис. 5.6,6) при более низких концентрациях фермент не отделяется от неактивного материала, в то время как при более высоких концентрациях необходимо увеличить концентрацию глюкозы в элюате и при этом глюкокиназа выходит в большем объеме элюата. При концентрации 10 мкмоль/г глюкокиназа не может быть элюирована даже при высоких концентрациях глюкозы она может быть снята только пропусканием 0,5 М хлорида калия. [c.75]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Рис. 5.8. Связываемость малатдегидрогеназы (1), лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи (2) и глицерокиназы (3) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе в зависимости от концентрации аффинного лиганда [8].

Геометрия колонок, концентрация и общее содержание аффинного лиганда — вот три основных параметра, которые определяют и связываемость, и емкость носителя. Для систем с высокой аффинностью высота колонки с аффинным сорбентом, содержащим высокие концентрации лиганда, мало влияет связываемость зависит от концентрации аффинанта, а не от высоты колонки. Это имеет практическое значение колонки, содержащие высокие концентрации лиганда, можно использовать для концентрирования разбавленных растворов ферментов. Кроме того, в системах с высокой аффинностью, в которых элюирование адсорбированных макромолекул без денатурации затруднено, разбавление аффинного сорбента немодифицированным гелем или уменьшение концентрации лиганда может способствовать элюированию в более мягких условиях. В некоторых случаях, конечно, фермент различает только концентрацию лиганда в гранулах модифицированного геля, которая, однако, не меняется при разбавлении. В таких случаях трудности элюирования остаются даже после разбавления геля [11]. Для взаимодействий систем с низкой аффинностью очень важна геометрия колонки. Для разделения специфически адсорбированных белков от неадсорбированных наиболее выгодно использовать длинные колонки, а не короткие. [c.80]

В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология