Неспецифическая сорбция

Назовем некоторые типичные лиганды с индивидуальной специфичностью. Мы не будем пока интересоваться химической природой лиганда и возможностями его закрепления на матрице об этом речь впереди. Сейчас попытаемся только сгруппировать наиболее употребительные типы лигандов по их функциональным признакам. Впрочем, одно замечание общего характера уместно сделать уже здесь в качестве лигандов нежелательно использовать вещества с ярко выраженной гидрофобностью, а также богатые ионогенными группами. В обоих случаях трудно будет избежать неспецифической сорбции примесей на таких лигандах. [c.361]

С увеличением исходной концентрации белкового лиганда абсолютное количество связавшегося материала медленно увеличивается, но доля связывания снижается ввиду стерических помех, которые создают друг для друга крупные молекулы белка при связывании с близко расположенными активными центрами матрицы. Кроме того, излишне высокая исходная концентрация лиганда стимулирует повышенный уровень неспецифической сорбции, что снижает избирательность сорбента. [c.376]

Последний из перечисленных методов представляет собой сочетание неспецифической сорбции с последующей избирательной десорбцией специфическими лигандами (субстратами, ингибиторами, эффекторами и т. п.). Предположим, фермент [c.9]

Однако кажущаяся простота метода и отсутствие у новичка представления о возможных трудностях, сопровождающих его применение на практике, могут привести к обескураживающим неудачам. Действительно, трудно заранее предугадать, какой аффинный лиганд полезнее выбрать — с высоким или низким сродством, какова наиболее благоприятная концентрация этого лиганда в сорбенте, какую роль должна играть матрица, какие носители подходят и какие не подходят для иммобилизации аффинного лиганда. Например, отлично зарекомендовавшие себя с точки зрения иммобилизации ферментов носители на основе кремнезема оказываются в ряде случаев совершенно непригодными для использования в аффинной хроматографии из-за высокой неспецифической сорбции. [c.5]

Применение для элюирования специфически сорбированных вешеств градиента pH и градиента концентрации соли и влияние ионной силы и неспецифической сорбции рассмотрены далее в гл. 10. [c.91]

Эффективность аффинной хроматографии снижается в основном из-за неспецифической сорбции инертных веществ. Неспецифические эффекты, как правило, очень слабы и проявляются главным образом во взаимодействующих системах с низким сродством. [c.94]

Исследование ренатурации ДНК с помощью сорбции на оксиапатите можно вести и в объеме. Например, аликвоты ДНК, рена-турирующей при температуре отжига, переводили в 0,156 М К-фосфатный буфер и смешивали с суспендированной в том же буфере кашицей оксиапатита, затем перемешивали в течение 15 мин и центрифугировали в настольной центрифуге. Выход однонитевой ДНК определяли в супернатанте, а всю остальную ДНК считали ренатурировавшей и сорбированной на оксиапатите. Для подавления неспецифической сорбции добавляли немеченную тимусную ДНК [Paetkau, Langman, 1975]. [c.242]

Далее следует сделать выбор между аниона- и катионообменни-ком. При фракционировании определенным образом заряженных молекул такой выбор не представляет труда. Например, очевидно, что олигонуклеотиды следует делить на анионообменнике, а заведомо щелочные белки, например гистоны,— на катпонообменнике. Для амфотерных молекул посредством выбора pH буфера можно задавать знак суммарного заряда и таким образом определять нужный тип ионообменника. Здесь решающим соображением может оказаться учет диапазона pH, в котором препарат (например, белок) сохраняет свою нативность, не склонен к агрегации или неспецифической сорбции. Если такой диапазон pH располагается по обе стороны от изоэлектрической точки очищаемого компонента исходной смеси, то выбор типа обменника может диктоваться оптимизацией условий разделения, как было пояснено выше, в разделе Хроматографический процесс . [c.287]

Перед использованием колонки с аффинным сорбентом ее имеет смысл промыть раствором бычьего сывороточного альбумина (2 мг/мл). Было замечено, что в результате этого улучшается качество очистки и фракционирования методом конкурентной элюции целого ряда ферментов. По-видимому, БСА блокирует на сорбенте места неспецифической сорбции ферментов [Ramadoss et al., 19831. [c.368]

Связь лиганда с поли(А)-мРНК осуществляется, естественно, за счет водородных связей между основаниями двух комплементарных последовательностей — поли(и) и поли(А). На прочность этой связи влияет наличие в жидкой фазе солей, катионы которых нейтрализуют заряды остатков фосфорной кислоты в обеих последовательностях. Важную роль играют также температура среды и присутствие в ней агентов, разрывающих водородные связи, например фор-мал1ида. Все это позволяет гибко варьировать условия связывания мРНК с сорбентом и ее элюции в целях подавления неспецифической сорбции РНК других типов. В этом отношении поли(и)-агароза имеет преимущество перед аналогичным сорбентом на базе целлюлозы — олиго(с1Т)-целлюлозой, заметно более склонной к неспеци- [c.371]

Довольно высокая концентрация соли, которую рекомендуется вводить в буфер для связывания лиганда (0,5 М), нужна для блокирования неспецифической сорбции ионного характера, которая свойственна Br N-активированной агарозе. Напомним, что лиганд связывается с матрицей через остаток изомочевины, который относительно легко протонируется с появлением положительного заряда на присоединенном двойной связью атоме азота [S hnaar et al., 1977]. [c.377]

Однако значительно большие возможности открывает нековалентное связывание НК с матрицей целлюлозы. Во-первых, его удается осуществить и для относительно малых фрагментов НК, а во-вторых, с целлюлозой можно связать и нативную двунитевую ДНК. Способы такого связыпания исиользуют неспецифическую сорбцию, вернее, запутывание нитей НК в сетке целлюлозы. Здесь ото происходит успешнее, чем в агарозе, у которой пустоты крупнее, а инти собраны в плотные жгуты. Во многих сл учаях связь оказывается достаточно прочной, чтобы обеспечить надежное задержание НК в колонке аффинного сорбента в условиях многократных промывок, связывания и элюции очищаемых макромолекул. [c.392]

В том же обзоре подробно описана методика пришивки под действием УФ-облучения РНК к целлюлозе, предложенная Смитом и соавторами. Единственное ее существенное отличие — в использовании метилцеллюлозы вместо обычной целлюлозы для снижения неспецифической сорбции по остаточным карбоксилам целлюлозы [Smith et al., 1972]. Впрочем, такую сорбцию нетрудно блокировать солью, и в недавней работе [Nygard et al., 1980] РНК УФ-облучением пришивали к обычной целлюлозе Whalman F-11 . Ввиду заметно меньшей молекулярной массы РНК уровень связывания был ниже — около 30%. [c.393]

Из рис. 134, А видно, что за 30 мин высокая степень связывания лактатдегидрогеназы на 5 -АМР-сефарозе достигается лишь начиная с исходной концентрации фермента 1 ед./мл (2 мкг/мл, если считать, что активность фермента составляет ориентировочно 500 ед./мг). Дальнейший ход зависимости полноты связывания от концентрации фермента имеет пологий характер. Процесс связывания фермента при малой его концентрации сильно растягивается во времени (рис. 134, В). Даже при исходной концентрации 0,1 ед./мл связать фермент полностью удается лишь за 16 ч. Очевидно, что такое замедление нельзя объяснить с чисто кинетических позиций соотношения концентрации реагентов (в растворе). Возможно, что имеет место временное задерживание диффундирующих молекул на местах неспецифической сорбции. Свой вклад дает и замедление диффузии белков внутри гранул за счет столкновений с сеткой матргщы. [c.402]

Этот выбор диктуется в основном стремлением сохранить нативность очищаемого белка и максимально уменьшить неспецифическую сорбцию других компонентов исходной смеси. Само аффинное связывание вещества с лигандом, как правило, от состава буфера я ид-кой фазы зависит мало. Интересами сохранения нативности и растворимости белка диктуются выбор pH, наличие соли, а иногда (например, для белков мебран) введение в буфер добавок органических растворителей или детергентов. Все это определяется известными свойствами данного белка. Неспецифическая сорбция примесей, в частности балластных белков, на матрице и спейсерах происходит за счет тех же самых сил (притяжения разноименно заряженных групп, водородных связей и гидрофобных взаимодействий), которые обусловливают и биоспецифическое снизывание вещества с лигандом. Избирательность и прочность аффинной связи обусловлены кооперативным действием различных сил в области связывания, где они дополняют друг друга. Благодаря такой кооперации имеется возможность ввести в буфер факторы, ослабляющие действие сил какого-либо типа или даже всех их одновременно, но в такой степени, что биоспецифическое аффинное взаимодействие будет ослаблено лишь частично, в то время как неспецифическую сорбцию удастся подавить практически полностью. [c.404]

Этими факторами служат, как обычно, повышенная концентрация соли, наличие гуанидинхлорида и мочевины, органических раство-рителей и детергентов. В зависимости от доминирующего характера неспецифической сорбции можно отдать предпочтение какому-нибудь одному из них или их комбинации. Разумеется, возможны слу- [c.404]

Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упомина.лось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. В таком случае следует элюцию вести в свободном объеме, промывая сорбент на фильтре (с периодическим перемешиванием). Заметим, что промывку сорбента в объеме выгоднее вести несколько раз небольшими пори иями элюента, чем сразу большим его объемом. Аффинная хроматография в свободном объеме удобнее, чем колоночная, и в том случае, когда нужный белок очень мало представлен в неочищенном экстракте, но хорошо связывается сорбентом. Хроматография в объеме позволяет использовать такую концентрацию суммарного белка в экстракте, с которой из-за вязкости было бы трудно работать на колонке. Аффинная сорбция в объеме широко ис1ю.1гьзуется в радио-иммунных методах исследования. [c.409]

Олигонуклеотиды несут большой отрицательный заряд, поэтому они с успехом могут быть разделены на слабых крупнопористых анио-нообменниках. Для этой цели используют колонки, заполненные ДЭАЭ-сефадексом, ДЭАЭ-целлюлозой, Эктеола-целлюлозой и др. Нуклеотиды элюируются с колонки в градиенте концентрации Na l в порядке увеличения их молекулярной массы. Для подавления неспецифической сорбции нуклеотидов на полисахаридных матрицах хроматографию проводят в присутствии 7 М мочевины. [c.177]

Пористое стекло (диаметр пор 5 — 250 нм), как и наиболее широко применяемые носители иа основе агарозы, отличается низкой неспецифической сорбцией и высокой емкостью. Аффинная хроматография нашла широкое применение при разделении ферментов, полнпептидных и белковых гормонов, антител, антигенов, а также транспортных и рецепторных белков. [c.354]

Преимуществами метода Касаи и Ишии [10] являются его чувствительность и простота для исследования необходимо лишь небольшое количество белка по сравнению с методом Данна и Чейкена [7] в этом методе концентрация фермента очень мала относительно Кй использование фронтального анализа упрощает выведенные уравнения объемы элюирования можно определить более точно, поскольку они практически не зависят от концентрации. При использовании этого метода для определения констант диссоциации химотрипсина на сфероне, к которому был привязан с помощью гидрофобного гексаметилендиамина N-бензилоксикар-бонилглицил- D-фенилаланин, Туркова и др. [15] встретились с трудностями, обусловленными, очевидно, неспецифической сорбцией. [c.54]

Привязка аффинанта к нерастворимому носителю в определенной мере сказывается на константе равновесия К - Увеличение К обусловлено модификацией аффинанта связыванием с матрицей, следствием чего является ограничение стерической доступности аффинанта. Напротив, уменьшение К вызывается неспецифической сорбцией фермента на нерастворимом носителе и на уже сорбированном ферменте. Если предположить, что в неочищенном препарате белка только один фермент имеет сродство к матрице, равновесие между привязанным аффинантом и выделяемым ферментом можно выразить следующим образом [c.62]

Для успешного выделения фермента с помощью аффинной хроматографии необходимы очень низкие значения К[ или Кь- Обе константы должны быть много меньше, чем любая константа диссоциации для неспецифической сорбции белка на поверхности матрицы. Максимум для Кь может быть оценен следующим образом. Исходя из концентрации ингибитора в нерастворимом аф-финанте, равной 10" моль/л, и требования 99%-ного связывания фермента при хроматографии неочищенного материала, содержащего 10 моль/л фермента в объеме, равном тройному объему нерастворимого аффинанта, в качестве верхнего предела для Кх получают значение 10 моль/л. В 3%-ном растворе белка, содержащем активный фермент с молекулярной массой 10 в количестве [c.62]

Адсорбционная энергия для неспецифической сорбции АОнеспец складывается из энергии гидрофобных, гидрофильных или даже ионных взаимодействий и сопоставима с адсорбционной энергией в обычной хроматографии. Она очень сильно зависит от природы нерастворимого носителя и белка. ДОнеспец должна быть по возможности низкой, потому что она включает также сорбцию молекул, которые образуют неспецифические комплексы с аффинантом. [c.63]

Однако обнаружено, что хроматография химотрипсина на незамещенной сефарозе не дает достаточных доказательств отсутствия неспецифической сорбции. Напротив, Хофсти [12] показал, что сефароза с иммобилизованным метиловым эфиром е-амино-капронил-о-триптофаном сорбирует, например, сывороточный альбумин или у-глобулин полностью неспецифически. [c.68]

Мешающее влияние неспецифической сорбции в биоаффинной хроматографии обсуждается подробно в разд. 5.8 и 10.3. Неспецифической сорбции можно лучше всего избежать, если использовать гидрофильные пространственные группы, получение которых описано в разд. 8.3. [c.72]

Смотреть страницы где упоминается термин Неспецифическая сорбция: [c.243] [c.289] [c.299] [c.322] [c.322] [c.353] [c.373] [c.373] [c.374] [c.374] [c.384] [c.401] [c.405] [c.405] [c.408] [c.425] [c.442] [c.443] [c.443] [c.446] [c.446] [c.29] [c.503] [c.24] [c.16] [c.68]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология