Рибонуклеаза окисленная

Доказать термодинамическую гипотезу свертывания очень трудно. Обычно полагают, что термодинамическая гипотеза подтверждается экспериментами по повторному свертыванию панкреатической рибонуклеазы [4351. В этих опытах восстановленная несвернутая рибонуклеаза повторно окислялась в присутствии 8 М мочевины причем образовывалась случайная система водородных связей. В результате получалось около 100 различных продуктов, каждый из которых характеризовался своим набором из 4 дисульфидных связей (возможны (2-4) /2 -4 = 105 систем связей S—S [436, 4371 кроме того, существуют различные теоретические возможности образования петель. Удаление мочевины и добавление меркаптоэтанола (рис. 4.3) приводило к постепенному и в конечном счете количественному образованию нативной структуры. Этот факт показывает, что исходя из 100 различных групп, находящихся в исходных конформациях, можно получить нативную структуру. Хотя это число и невелико, данный опыт свидетельствует об уникальности продукта свертывания, однако он не позволяет решить вопрос о локальном или глобальном минимуме. [c.182]

На примере рибонуклеазы (фермента, гидролизующего РНК) было показано, что дисульфидные связи могут восстанавливаться под действием избытка 2-меркаптоэтанола в водном растворе мочевины (рис, 11,13, а). Денатурированная полипептидная цепь рибонуклеазы теряет при этом ферментативную активность. После отмывания от реагентов денатурированная цепь рибонуклеазы постепенно окисляется кислородом воздуха и возвращается к исходной пространственной структуре (рис. П. 13, б). При этом у ренатурированной цепи рибонуклеазы почти полностью восстанавливается ферментативная активность. [c.372]

Нативная рибонуклеаза не чувствительна к действию трипсина и химотрипсина. Поэтому сначала проводили окисление рибонуклеазы (остатки цистина при. этом окислялись до остатков цистеиновой кислоты) и окисленный препарат подвергали затем действию протеолитических ферментов. При помош,и хроматографии на дауэкс 50-Х-2 [82] из триптического гидролизата было выделено 15 пептидных фрагментов [82], а из гидролизата после действия химотрипсина — 32 фрагмента [83]. Для количественного определения аминокислотного состава выделенных пептидов и для достижения их чистоты необходимо использовать достаточное количество исходного материала (200 мг). Фракции, содержащие более одного компонента, подвергают повторному фракционированию в несколько измененных условиях. Расщепление с помощью пепсина [6], хотя оно и не столь селективно, позволяет, однако, получить другие пептиды, которые помогают воссоздать полную структуру рибонуклеазы. [c.415]

В определенных условиях молекулу рибонуклеазы можно расщепить с помощью фермента субтилизина. При этом разрывается связь между 20-м (аланин) и 21-м (серии) остатками и образуется два пептида — короткий (называемый 5-пептидом), содержащий 20 остатков, и более длинный (называемый 5-белком) из 104 остатков. Поскольку первый остаток цистеина находится в молекуле на 26-м месте, отщепление 5-пептида, состоящего из 20 первых аминокислотных остатков, равнозначно отщеплению хвоста фермента. По отдельности ни хвост , ни 5-белок не проявляют ферментативной активности, но их экви-молярная смесь активна. Очевидно, несмотря на разрыв связи между 20-м и 21-м остатками, благодаря взаимодействию боковых цепей образуется активная третичная структура. Если, так же как это делалось в случае нативного фермента, восстановить, а затем вновь окислить 5-белок, то получающийся продукт ничем не отличается от первоначального 5-белка. После добавления к реконструированному 5-белку 8-пептида активность в большой степени восстанавливается. По-видимому, правильное образование дисульфидных связей происходит и в отсутствие 5-пептида. Однако он все же несет какую-то определенную функцию, так как в его присутствии уменьшается количество осадка, состоящего, как предполагают, из молекул, связанных поперечными связями. Если опыт по восстановлению и последующему окислению производится с раствором, содержащим как 5-пептид, так и 5-белок, процент растворимого активного материала оказывается более высоким. [c.280]

Изучено также пространственное строение панкреатической рибонуклеазы. Наиболее известной особенностью рибонуклеазы является ее способность обратимо восстанавливать нативную пространственную конформацию после разрыва всех 4 дисульфидных мостиков при обработке (3-меркаптоэтанолом и 8 н. раствором мочевины, действующими на водородные связи. После удаления этих реагентов белок повторно свертывается и окисляется, восстанавливая прежние свойства. Более того, фермент остается активным даже после разрыва полипептидной связи между Ala 20 и Ser 21 остатками. Реконструкция осуществляется под влиянием межвитковых взаимодействий боковых заместителей основной полипептидной цепи. [c.115]

В ходе того же эксперимента было получено еще одно доказательство точности свертывания рибонуклеазы при ее ренатурации. Оказалось, что восемь остатков цистеина, образ овавщихся в реакции восстановления остатков цистина в полностью развернутой рибонуклеазе, постепенно окисляются под действием атмосферного кислорода, в результате чего образуются четыре внутрицепочечные дисульфидные связи точно в тех же положениях, что и в исходной нативной рибонуклеазе. Это замечательное явление. Случайная комбинация восьми остатков цистеина с образованием остатков цистина теоретически может дать 105 различных вариантов, однако в ходе ренатурации реализуется один-единственный специфический набор дисульфидных поперечных связей, характерный для нативной рибонуклеазы (рис. 8-8). Таким образом, полипептидная цепь денатурированной рибонуклеазы свертывается очень точно, что и приводит к формированию уникальной биологически активной конформации, исключая образование какой бы то ни было неправильной конформации. Этот классический эксперимент, выполненный Кристианом Анфинсеном в 50-х годах, доказал, что аминокислотная последовательность полипептидной цепи содержит всю информацию, необходимую для того, чтобы цепь свернулась в нативную трехмерную структуру. [c.197]

Было приведено более убедительное доказательство присутствия щелочеустойчивых динуклеотидных участков в рибонуклеиновой кислоте. Такая устойчивость является результатом присутствия 2 -замещенных соединений, вероятно 2 -0-метильных производных нуклеотидов [119, 200, 201]. Деградация изолированных динуклеотидов посредством обработки фосфомоноэстеразой с последующим периодатным окислением и элиминированием фосфата приводит к замещенным мононуклеотидам после дефосфорилирования последние образуют соединения нуклеозидного характера, которые не окисляются перйодатом. По своему поведению при хроматографии углеводный компонент идентичен 2(или 3)-0-метилрибозе [200]. Метилирование 2 -гидроксильных групп в рибонуклеиновой кислоте должно сообщать ей устойчивость к расщеплению как щелочью, так и панкреатической рибонуклеазой [202]. [c.401]

Хере обнаружил, что, когда надмуравьиную кислоту окисляют при 0° (а не при —10°), до 10% тирозина превращается в хлортиро-зин. При более высоких температурах это превращение протекает более интенсивно. Если перед окислением белка из раствора удалить ионы хлора, то можно без опасения работать при более высокой температуре, например при 0°. Свободную от хлоридов рибонуклеазу можно получить, пропуская 10%-ный раствор этого белка в 0,01 М уксусной кислоте через короткую колонку, с набивкой из дауэкс [c.99]

Участие аминокислот в образовании активного каталитического центра удалось внимательно исследовать в рибонуклеазе. Рибонуклеаза состоит только из одной пептидной цепи из 124 остатков аминокислот , последовательность которых довольно хорошо изучена. Фермент имеет 4 дисульфидных мостика, которые поддерживают петли пептидной цепи, и рибонуклеаза принимает характерную для нее конформацию (рис. 60). При восстановлении дисульфидных связей образуется 8 SH-rpynn и фермент теряет свою активность. Восстановленную рибонуклеазу можно окислить воздухом при pH 7, и тогда ее активность возвращается в большой мере. [c.213]

В непрерывной полипептидной цепи рибонуклеазы попарно связаны дисульфидными мостами остатки цистеина, обозначенные одинаковыми номерами. Очевидно, что сама по себе последовательность аминокислот в молекуле рибонуклеазы еще совершенно ничего не говорит о ее каталитическом действии на связь фосфорной кислоты с рибозой в РНК. В высшей степени интересны исследования рибонуклеазы, выполненные Анфинсеном. Если подействовать р-оксиэтилмеркаптаном на раствор рибонуклеазы в водном 50%-ном растворе мочевины (где а-спираль нарушена полностью) и таким образом разорвать все S-S-мосты, то каталитические свойства ферментов полностью исчезают. Однако если полученный белок, содержащий 8Н-группы на месте S—S-мостов и освобожденный от мочевины, окислить воздухом, то все SH-группы попарно окисляются в S—S-мосты, структура рибонуклеазы воссоздается, и вновь приобретается активность. Следовательно, S-S-мосты в данном белке (и это типично) возникают на прежних местах и, несомненно, одновременно воссоздается не только вторичная, но и третичная структура, свойственная рибонуклеазе. Если же окисление производить в растворе мочевины, где обычные водородные связи вторичной структуры нарушены, то сшивание происходит в беспорядке или в ином порядке и активного фермента не получается. Таким образом, как оказалось в этом случае, пе дисульфидные мосты, а водородные связи вторичной структуры предопределяют третичную структуру, сближающую определенные цистеиновые SH-группы и создающие возможность окисления их в цистиновые мосты S—S. Вместе с тем ясно, что за ферментативную активность ответственна совокупность первичной, вторичной и третичной структур. [c.743]

Особенно наглядно эти закономерности удалось проследить на примере обратимой денатурации цпстинсодержащих одноцепочечных белков, таких, как рибонуклеаза, химотрипсин пепсиноген Было показано, что полностью восстановленная и ферментативно неактивная рибонуклеаза быка может быть окислена воздухом с восстановлением активности После восстановления и реокисления молекула, по-видимому, имеет ту же самую вторичную и третичную структуры, что и исходный нативный фермент [c.157]

Нуклеиновые кислоты поступают в организм с пищей главным образом в составе нуклеопротеи-нов и высвобождаются в результате действия протео-литических ферментов кишечника. Панкреатический сок содержит рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, гидролизующие нуклеиновые кислоты до нуклеотидов. Полинуклеотидазы или фосфоэстеразы кишечника, дополняя действие панкреатических нуклеаз, также гидролизуют нуклеиновые кислоты до мононуклеотидов. Далее, под воздействием нуклеотидаз и фосфатаз происходит гидролиз нуклеотидов до нуклеозидов, которые либо всасываются, либо под воздействием фосфатаз слизистой кишечника деградируют до пуриновых и пиримидиновых оснований. Основания могут подвергаться окислению гуанин, например, окисляется до ксантина и затем до мочевой кислоты аденозин превращается в инозин, затем в гипоксантин и далее в мочевую кислоту (рис. 35.1). Мочевая кислота всасывается в кишечнике и затем выделяется с мочой. В организме человека большая часть пуринов, высвободившихся из нуклеиновых кислот, которые поступают с пищей, превращается в мочевую кислоту (при этом не происходит их включения во вновь образующиеся молекулы нуклеиновых кислот). Свободные пиримидины, скармливаемые крысам, также в основном катабо-лизируются и выделяются без включения в нуклеиновые кислоты тканей организма. Таким образом, нуклеиновые кислоты пищи практически не выступают в роли поставщика непосредственных предшественников нуклеиновых кислот тканей организма. [c.15]

Совершенно другие ршультаты получаются, если восстановленную (денатурированную) рибонуклеазу подвергнуть окисле- [c.40]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология