Цистеиновая кислота определение

БЫСТРОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИСТЕИНА И ЦИСТИНА В ФОРМЕ ЦИСТЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ОБРАЗЦАХ РАСТИТЕЛЬНОГО [c.262]

Нативная рибонуклеаза не чувствительна к действию трипсина и химотрипсина. Поэтому сначала проводили окисление рибонуклеазы (остатки цистина при. этом окислялись до остатков цистеиновой кислоты) и окисленный препарат подвергали затем действию протеолитических ферментов. При помош,и хроматографии на дауэкс 50-Х-2 [82] из триптического гидролизата было выделено 15 пептидных фрагментов [82], а из гидролизата после действия химотрипсина — 32 фрагмента [83]. Для количественного определения аминокислотного состава выделенных пептидов и для достижения их чистоты необходимо использовать достаточное количество исходного материала (200 мг). Фракции, содержащие более одного компонента, подвергают повторному фракционированию в несколько измененных условиях. Расщепление с помощью пепсина [6], хотя оно и не столь селективно, позволяет, однако, получить другие пептиды, которые помогают воссоздать полную структуру рибонуклеазы. [c.415]

Анализ. Методы анализа белковых макромолекул селективны и осуществляются в зависимости от того, какая структура является объектом исследования, и начинаются с определения аминокислотного состава. Для этого необходимо провести полный гидролиз пептидных связей и получить смесь, состоящую из отдельных аминокислот. Гидролиз проводят при помощи 6 М соляной кислоты при кипячении в течение 24 ч. Так как для гидролиза пептидных связей изолейцина и валина этого может быть недостаточно, проводят контрольный 48- и 72-часовой гидролиз. Некоторые аминокислоты, например триптофан, при кислотном гидролизе разрушаются, поэтому для их идентификации используют гидролиз при помощи метансульфоновой кислоты в присутствии триптамина. Для определения цистеина белок окисляют надмуравьиной кислотой, при этом цистеин превращается в цистеиновую кислоту, которую затем анализируют. Вьщеление и идентификацию аминокислот проводят при помощи аминокислотных анализаторов, принцип действия которых основан на хроматографическом разделении белкового гидролизата на сульфополистирольных катионитах, В основе количественного определения той или иной аминокислоты лежит цветная реакция с нингидрином, однако более перспективным следует считать метод, при котором аминокислоты модифицируют в производные, поглощающие свет в видимом диапазоне. Разделение смеси аминокислот проводят при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, а само определение — спектрофотометрически. Следующим этапом является определение концевых аминных и карбоксильных [c.40]

Фотодинамическое действие реализуется не через разрывы пептидных связей, а прежде всего через окисление остатков таких аминокислот, как гистидин, триптофан, тирозин, метионин, цистеин, причем наиболее легко окисляется гистидин и триптофан. Варьируя красители и характеристики среды, можно достичь более или менее избирательной деструкции определенных аминокислот. Например, гистидин разрушается при pH 6 (азот ими-дазола ионизирован), тирозин — при рН>10 (ионизирована гидроксильная группа фенольного кольца). Как правило, экспонированные иа поверхности белковой глобулы аминокислоты разрушаются более эффективно, чем расположенные в ее сердцевине. При измерении методом флеш-фотолиза переходных спектров поглощения тирозина и триптофана Гросвейнером было показано, что, как и УФ-облучение, видимый свет в присутствии эозина (фотодинамический эффект) приводит к образованию одних и тех же лабильных промежуточных продуктов — аланин-феноксильных и 3-индольных свободных радикалов соответственно. Конечными стабильными продуктами фотоокисления триптофана являются кинуренины и меланины, цистина — цистеиновая кислота гистидин и тирозин дают большой набор продуктов. [c.346]

Цистеин(определенная как цистеиновая кислота + /г цистина 0,67 0,08 2,0 [c.364]

По результатам определения содержания цистеиновой кислоты или 5-карбоксиметилцистеина нельзя судить о том, присутствуют ли в белке цистеин и цистин или только один из них. Таким образом, по числу остатков цистеиновой кислоты или 5-карбоксиметил-цистеина судят о содержании полуцистина. Для установления соотношения между цистеином и цистином в белке можно определить содержание тиоловых групп (т. е. содержание цистеина) различными методами, например с помощью реагента Эллмана (разд. 4.1.3.3). Если известно суммарное содержание полуцистина и определено количество тиоловых групп (цистеина), можно рассчитать содержание в белке цистина. [c.168]

Одно из достоинств метода ТСХ — его быстрота. Анализ аминокислот этим методом требует значительно меньше времени, чем хроматографирование на бумаге. Так, двумерное хроматографирование на бумаге длится несколько дней, тогда как методом ТСХ его можно осуществить за 4—5 ч. Другое преимущество ТСХ — повышенная чувствительность. Например, чувствительность определения гистамина этим методом в 2 раза выше, а чувствительность определения цистеиновой кислоты в 50 раз выше [24]. При двумерном разделении различие в чувствительности еще больше и для отдельных кислот может возрастать в 250—500 раз. [c.478]

Хроматография может- быть выполнена двумя различными способами в зависимости от того, в каком источнике нужно определить цистеиновую кислоту 1) в корме или 2) в определенном белке. [c.263]

В случае 1) на пластинку наносят равные в расчете на сухой вес исходного образца порции гидролизатов. В случае 2) должно быть известно содержание азота в каждом образце и на основании этих данных наносят на пластинку порции гидролизатов, эквимолярные по содержанию белка в исходных образцах. Например, если определяют содержание цистеиновой кислоты в образцах корма, целесообразно наносить гидролизаты полосками шириной в 1 см по 0,5 мг каждого образца в объеме 20 мкл. Если же определяют количество цистеиновой кислоты в образцах определенного белка, то гидролизаты разбавляют (после удаления кислоты) и из каждого наносят [c.263]

Хроматографическое определение глютаминовой, аспарагиновой и цистеиновой кислот с помощью анионообменных смол [380]. [c.226]

Определение числа и природы С- и М-концевых аминокислотных остатков позволило добиться существенных успехов в выяснении структуры некоторых белков. Инсулин оказался первым белком, для которого полностью установлен порядок расположения всех аминокислот [102—107]. Сангер и его сотрудники путем окисления инсулина надмуравьиной кислотой получили два основных продукта, которые оказались пептидами, содержащими цистеиновую кислоту и состоящими из 21 и соответственно 30 аминокислотных остатков. Более короткая цепь (по обозначению Сангера — пептид А ) имеет Ы-концевой остаток глицина и С-концевой остаток аспарагина. В более длинной цепи (пептид В ) Ы-концевой аминокислотой оказался фенилаланин, а на С-конце цепи находится аланин. С помощью остроумных приемов, заключающихся в широком использовании метода получения динитрофенильных производных при помощи [c.27]

Для обнаружения и количественного определения аминокислот по окончании разделения высушенные хроматограммы обрабатывают 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Аминокислоты проявляются в виде фиолетовых пятен пятна вырезают, окрашенный комплекс извлекают спиртовым раствором сернокислой меди и интенсивность окраски измеряют при длине волны 575 ммк. По калибровочным кривым, построенным для каждой аминокислоты, находят концентрацию компонентов смеси. Определение цистина производят после превращения его в цистеиновую кислоту путем предварительного окисления белка надмуравьиной кислотой (см. гл. IV, 1). [c.44]

Было найдено, например, что при действии разбавленных водных растворов надкислот на шерсть все дисульфидные связи этого белка легко доступны реагенту и окисляются им полностью [63]. Требуемая продолжительность реакции зависит от диаметра волокна, концентрации надкислоты и температуры. Типичные результаты, полученные при проведении этой реакции, представлены в табл. У1-31. Следует отметить, что при взаимодействии с надкислотой шерсть не переходит в раствор, и лишь последующий исчерпывающий гидролиз приводит к растворению продукта. После гидролиза весь цистин, окисленный надкислотой, может быть определен в виде цистеиновой кислоты [259], причем в гидролизате наблю- [c.401]

В растворе бисульфита и обладает значительно меньшей растворимостью в щелочных, кислых и окислительных (надуксусная кислота в аммиачном растворе) средах. Работа при растяжении элементарных волокон шерсти при этом также возрастает, что указывает на восстановление прочности, снижающейся у шерсти в результате восстановления. В отличие от этих результатов было обнаружено, что обработка шерсти в восстановленной форме монофункциональным малеимидом не приводит к улучшению каких-либо механических или химических свойств модифицированной таким образом шерсти по сравнению со свойствами восстановленной шерсти. Определение цистина в модифицированных продуктах показало, что с малеимидами реагирует лишь часть меркаптогрупп, тогда как остальные цистеиновые фрагменты вновь окисляются воздухом, образуя цистиновые дисульфидные мостики. Более прямое доказательство реакции сульфгидрильных групп шерсти в восстановленной форме С малеимидами было получено, когда методом бумажной хроматографии в гидролизате моди- [c.413]

Фиг. 56. Определение цистеиновой кислоты в гидролизатах растительных белков на пластинке Фиксион 50 X 8 .

Несколькими исследователями разработаны ускоренные методы хроматографического анализа аминокислот не только для обнаружения многих врожденных дефектов метаболизма, о которых упоминалось выше, но и для быстрого анализа многих аминокислот физиологических жидкостей. Так, Льюис [79] использовал короткую ионообменную колонку для определения метионина и цистина. Для разделения при комнатной температуре была использована колонка размером 40X1.5 см, заполненная смолой зеокарб-225 (>200 меш) пробу предварительно окисляли. При скорости течения буферного раствора 200 мл/ч цистеиновая кислота элюируется при объеме элюата 36—40 мл. [c.13]

Определение цистина и цистеина осложняется их нестойкостью при кислотном гидролизе, особенно в присутствии углеводов. Цистин, пред-ставляюш ий собой окисленную форму аминокислоты, может быть получен в виде пика, выходящего с ионообменных колонок при вымывании цитрат-ным буфером с pH 3,42 между аланином и валином. Его точное положение сильно зависит от pH используемого буфера [3]. Количество цистина в гидролизате нельзя считать идентичным его содержанию в белке, так как может происходить превраш ение цистеина в цистин, вероятно, с частичным дальнейшим окислением в цистеиновую кислоту. [c.148]

Хартел и Плеймикерс [112] использовали бумагу с четвертичными азотными группами для количественного определения цистеиновой кислоты в гидролизате белков. В восходящем методе хроматографии проявляли 0,34 М хлоруксусной кислотой. После проявления высушенную бумагу обрабатывали нингидрином для обнаружения красных пятен и с помощью денситометра определяли количество цистеиновой кислоты в пятне. По мнению авторов, ни одна из аминокислот, найденных в белке, не перекрывалась с цистеиновой кислотой. Точность метода была проверена авторами на шестнадцати определениях этой кислоты в гидролизате 1 г шерсти. Средние значения составили 1,25% при относительной средней ошибке 3%. [c.323]

Определение серусодержащих аминокислот. Большинство исследователей считает, что при кислотном гидролизе цистин и цистеин сильно разрушаются и их следует определять, проводя отдельный анализ [63, 65]. Хороший метод для этой цели был разработан Муром [56]. Подлежащий исследованию белок предварительно (для окисления цистина и цистеина в устойчивую при кислотном гидролизе цистеиновую кислоту) обрабатывается надмуравьиной кислотой [64]. Избыток надмуравьиной кислоты разрушается воздействием НВг, легко удаляемой из системы под вакуумом. После гидролиза в 6 и. растворе НС1 проводится анализ на ионнообменной колонке с сульфированным полистиролом (Дауэкс 50X8), при котором цистеиновая кислота определяется с высокой точностью. В других случаях для окисления цистеина в цистин гидролизат белка подщелачивают до pH 6,8 и оставляют на воздухе в течение 4 ч [53]. [c.192]

Полученные результаты указывают на присутствие приблизительно половины цистинового остатка на 11 аминокислот. То же самое соотношение было найдено Дейчем и Мортоном [31] при определении цистина непосредственно в виде более стабильной цистеиновой кислоты или в виде S-карбо-ксиметилцистеиновых производных. Поскольку свободные сульфгидрильные группы не обнаружены [5], молекула должна иметь около 8 дисульфидных мостиков на моль (28 800 г). Цистин и метионин фактически содержат всю серу белка (2,2% [5]). Количество лизина находится в полном соответствии с содержанием, найденным при гидролизе полностью динитрофенилированного гликопротеина [32]. Содержание триптофана обычно значительно меньше одного моля на 28 800 г белка, определенного как химически, так и спектрофотометрически [5, 28, 12], однако в литературе не было данных о получении препаратов, не содержащих триптофана. Содержание тирозина в различных [c.28]

Четвертой, не упомянутой выше, но приобретающей в последнее время все больший интерес, задачей, разрешаемой при помощи химического изменения белков, является применение его в качестве вспомогательного средства при исследовании порядка чередования аминокислотных остатков. и определения концевых групп в белках. Работа в этом направлении была существенно облегчена введением метода Зангера [9] и весьма широко проводится английскими биохимиками. Новый способ отличается от обычного способа приготовления белковых производных или измененных белков тем, что полученные соединения гидролизуют и образующиеся производные аминокислот изолируют. Часто этим способом исследуют структуру не только нативных белков, но и продуктов неполного ферментативного или кислотного гидролиза, а также структуру продуктов частичного окисления. При разрыве поперечных цистиновых связей (—S—S—) путем окисления до остатка цистеиновой кислоты (—SO3H), которое также было введено Зангером [10], молекула белка распадается на отдельные полипептидные цепи. Тристрам [11] (статья III) и Фокс [12] произвели оценку точности аналитических результатов этого важного исследования. [c.270]

Иодометрическое определение. Окуда [730] окислял цистин до цистеиновой кислоты КВгОз в кислом растворе. Присутствие других аминокислот мешает этому методу определения. Позже [731—733] он титровал гидролизат, обесцвеченный активированным углем, при помощи KJO3 в кислом растворе, содержащем KJ, окисляя [c.115]

Если цистеиновую кислоту определяют с помощью окисления надмуравьиной кислотой, анализ остальных аминокислот обычно проводят в отдельном гидролизате неокисленного белка. Бидмид и Лей [109] разработали метод одновременного определения всех аминокислот, включающий окисление. Однако в этом случае стадия окисления является более критической дополнительное неудобство состоит в частичном окислении тирозина в смесь моно- и дихлортирозина. [c.148]

Предварительные исследования нерастворимой ДНФ осажденной фракции [34] показали, что это сложное вещество обладает несколькими N-концевыми остатками и дисульфидными связями. Окисление его надмуравьиной кислотой с последующей гель-фильтрацией на сефадексе Г-25 приводило к разделению на четыре главных и меньший пятый компоненты. Углеводы были найдены главным образом только в одной из полос молекулярный вес этой фракции, определенный по поглощению в ультрафиолетовой области ДНФ-грунпы, был равен 4170. Аминокислотный состав выделенной фракции был следующим аспарагиновая кислота (1), треонин (2), серин (1), глутаминовая кислота (2), пролин (4), глицин (1), аланин (2), изолейцин (1), лейцин (2), тирозин (2), фенилаланин (1), аргинин (1) и цистеиновая кислота (3). Анализ углеводов позволил установить, что на ДНФ-группу приходится 2,8 остатка гексоз и 2,6 остатка гексозаминов. Обработка этой фракции проназой, пепсином и химотрипсином с последующим фракционированием гель-фильтрацией на сефадексе Г-25 позволило выделить фракцию, которая содержала, кроме углеводов, только тирозин и аспарагиновую кислоту. Таким образом, вполне вероятно, что углеводная часть связана с остатком аспарагиновой кислоты пептидной цепи. [c.238]

Эти различия объясняются не только сортовыми, видовыми или технологическими различиями, а главным образом условием проведения гидролиза пищевого продукта. При стандартном кислотном гидролизе (6н. НС1, ПО—120°С, 22—24 ч) происходит частичное разрушение некоторых аминокислот, в том числе треонина, серина (на 5—10%) и особенно метионина (30—60%) и цистина 56—60% (см., например, работу [14]), а также практически полное разрушение триптофана [16]. Этот процесс усиливается в присутствии больших ( лее 50% на сухую массу) количеств углеводов в продукте. Несколько уменьшить это разложение можно за счет более сильного разбавления образца серной кислотой (например, вместо 100 мг белка берут 2—5 мг), но границы этого разбавления определяются чувствительностью прибора и в большинстве случаев они не могут быть очень большими. Для количественного определения метионина и цистина рекомендуется проводить предварительное окисление их надмуравьиной кислотой [14, 24]. При этом цистин превращается в цистеиновую кислоту (цветовой выход 1,75), а метионин — в метионин-сульфон (цветовой индекс — 0,8), которые весьма устойчивы при последующем кислотном гидролизе. Окисление проводится по методике, описанной в работах [12, 14], при температуре 4° С в темноте в течение 1 — 10 ч из расчета 1 мл надмуравьиной кислоты на 2—5 мг белка. Немедленное и тщательное удаление надмуравьиной кислоты после окончания гидролиза (например, в роторе или вакуум-эксикаторе над NaOH) предотвращает потери. [c.282]

При разделении и очистке цистинсодержащих пептидов необходимо располагать избирательным методом обнаружения. Широкое применение находит определение аминокислотного состава фракций после окисления пептидов надмуравьиной кислотой [41]. По наличию в пептиде остатка цистеиновой кислоты выявляют фракции, содержащие цистин. Показано, что сера [c.173]

Если обработать белок избытком надмуравьиной кислоты, то остатки цистеина и цистина окисляются до остатков цистеиновой кислоты. При полном гидролизе цистеиновая кнслота освобождается почти количественно и легко определяется с помощью ионообменной хроматографии. В другом методе дисульфидные связи восстанавливают избытком меркаптоэтанола в 6 М гуанидингид-рохлориде при этом образуются остатки цистеина. Последние прн реакции с иодацетатом превращаются в остатки 5-карбоксиметил-цистеина. 5-Карбоксиметилцистеин стабилен при кислотном гидролизе в присутствии восстановителей и может быть определен путем ионообменной хроматографии. [c.168]

Описанные методы применимы к белкам, состоящим из одной полипептидной цепи, не имеющей дисульфидных связей. В тех же случаях, когда в белка имеются дисуль-фидные связи или более одной полипептидной цепи, то необходимы дополнительные методические приемы Например, если белок содержит две или более полипептидные цепи, соединенные нековалентными связями, то, воздействуя денатурирующими агентами, такими, как мочевина или гуанидинги-дрохлорвд, вызывают диссоциацию цепей. Диссоциированные цепи разделяют и толь ко после этого приступают к определению последовательности аминокислот в каждой из них. Если же полипептидные цепи соеди нены ковалентными дисульфидными связями, как это имеет место в инсулине, то их окисляют надмуравьиной кислотой при этом дисульфидные связи разрываются и образуются остатки цистеиновой кислоты (рис. 2.32). [c.32]

Из вышерассмотренного анализа третичной структуры белковой молекулы можно вывести следующее определение третичной структуры это структура белка, обусловленная взаимодействием цистеиновых аминокислотных остатков, либо это клубок, фиксированный дисульфидными мостиками. Хотя в общем случае не исключено, что отдельные элементы (т.е. петли) клубка могут быть образованы взаимодействием и других аминокислот водородными связями с участием ОН-групп серина и треонина, ионными связями аммонийно-карбоксилатного типа ОСО-) остатков лизина (аргинина) и аспарагиновой (глутаминовой) кислоты. Но такие петли будут нестойкими и легко разрушаться при действии рас-т орителя, изменении pH среды и т.д. [c.99]

Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. Кроме того, такие меченые аминокислоты служат в качестве реперных точек при исследовании неполного гидролиза (1346). В этом отношении полезными являются также е -аминогруппы лизина. Путем неполного гидролиза, осуществляемого с помощью кислоты и различных типов ферментов, оказалось возможным разрывать длинные полипептидные цепи в различных точках и путем анализа установить единственно возможную конфигурацию. Этим способом Зангер и Таппи[99]и Зангер и Томпсон [100] определили порядок чередования аминокислот в двух типах цепей, входящих в состав инсулина (табл. 27). Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином (цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь (цепь А) — из 21 остатка. Порядок чередования аминокислот и их содержание даны в табл. 27. Можно отметить следующее. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. Три ароматические аминокислоты (фен.фен.тир.) расположены последовательно, и два остатка глутаминовой кислоты связаны с двумя остатками ци-стеина (глу.глу.цис.цис.). В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два — рядом друг с другом в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях — неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов — четыре в цепи А и две в цепи В. [c.255]

В непрерывной полипептидной цепи рибонуклеазы попарно связаны дисульфидными мостами остатки цистеина, обозначенные одинаковыми номерами. Очевидно, что сама по себе последовательность аминокислот в молекуле рибонуклеазы еще совершенно ничего не говорит о ее каталитическом действии на связь фосфорной кислоты с рибозой в РНК. В высшей степени интересны исследования рибонуклеазы, выполненные Анфинсеном. Если подействовать р-оксиэтилмеркаптаном на раствор рибонуклеазы в водном 50%-ном растворе мочевины (где а-спираль нарушена полностью) и таким образом разорвать все S-S-мосты, то каталитические свойства ферментов полностью исчезают. Однако если полученный белок, содержащий 8Н-группы на месте S—S-мостов и освобожденный от мочевины, окислить воздухом, то все SH-группы попарно окисляются в S—S-мосты, структура рибонуклеазы воссоздается, и вновь приобретается активность. Следовательно, S-S-мосты в данном белке (и это типично) возникают на прежних местах и, несомненно, одновременно воссоздается не только вторичная, но и третичная структура, свойственная рибонуклеазе. Если же окисление производить в растворе мочевины, где обычные водородные связи вторичной структуры нарушены, то сшивание происходит в беспорядке или в ином порядке и активного фермента не получается. Таким образом, как оказалось в этом случае, пе дисульфидные мосты, а водородные связи вторичной структуры предопределяют третичную структуру, сближающую определенные цистеиновые SH-группы и создающие возможность окисления их в цистиновые мосты S—S. Вместе с тем ясно, что за ферментативную активность ответственна совокупность первичной, вторичной и третичной структур. [c.743]