Рибонуклеаза, структура

В число наиболее известных гидролитических ферментов, для которых получены сведения о структуре и механизме действия, входят экзопептидаза карбоксипептидаза А (гл. 6), рибонуклеаза А (гл. 3) и лизоцим. В настоящей главе мы рассмотрим химию последнего. [c.238]

Рис. 3-25. Модель пространственной структуры рибонуклеазы А [218].

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

Изучение молекулярной структуры фермента рибонуклеазы и ее связи с каталитической активностью [c.776]

Определение строения белков является очень сложной задачей, но за последние годы в химии белка достигнуты значительные успехи. Полностью определена химическая структура нескольких белков гормона инсулина (см, рис. 53), фермента, расщепляющего нуклеиновые кислоты, — рибонуклеазы (см. рис. 54), фермента лизоцима (рис. 56), [c.375]

Рис. 22. Вторичные структуры РНК-компонеита рибонуклеазы Р из Е. со И и Вас.

Гидролизующий полинуклеотиды бактериальный фермент, который широко используется для анализа ближайших соседей (гл. 2, разд. 3,4), может осуществлять гидролиз ДНК и РНК до З -нуклеотидов. Установлена трехмерная структура молекулы нуклеазы стафилококков, состоящей из 149 аминокислотных остатков [69—71]. Так же как и в случае панкреатической рибонуклеазы, молекулу нуклеазы стафилококков можно расщепить на два активных пептида (фрагменты, построенные из остатков 6—48 и 49—149), которые, соединяясь, образуют комплекс, обладающий ферментативной активностью [71, 72]. Комплекс образуется даже в том случае, когда от меньшего пептида отщеплены остатки 43—48. Однако остаток 01и-43, который связывает имеющий существенное значение ион Са +, необходим для проявления ферментативной активности [72], так же как и пептидная связь с соседним треонином (Тге-44). [c.124]

Если проанализировать все проведенные синтезы Меррифилда (табл. 2-9), то станет ясно, что это в основном работы в период между 1968 и 1972 гг. В это время во многих новых лабораториях — а их количество в США со времени опубликования концепции Меррифилда увеличилось в десять раз — начали проводить синтезы пептидов на носителях, чему в значительной степени способствовала коммерческая доступность синтезаторов. Очевидно, разочаровывающие результаты при попытках синтеза белков привели к реалистической оценке возможностей метода. Попытка синтеза лизо-цима привела, например, к смеси полипептидов, которая обладала 0,5—1% специфической активности [455]. Гораздо успешнее был синтез рибонуклеазы А [449], хотя и в этом случае выход составлял всего 16%. На этом ферменте с помощью твердофазной техники проведено интересное изучение взаимосвязи строения и активности [467]. Несомненно, что биологическая активность не является критерием гладкого течения твердофазного синтеза. Синтез белка, состоящего из 188 аминокислот, который сначала считали гормоном роста человека, дал смесь белков с заметной биологической активностью. Несколько позднее было, однако, показано, что положенная в основу синтеза первичная структура не подтвердилась [453, 468]. Синтез длинноцепочечных пептидов и белков по методу Меррифилда в настоящее время и в обозримом будущем уже не может отвечать тем высоким требованиям, которые предъявляются к синтезу биологически активных соединений. [c.193]

Рис. 3-24. Первичная структура рибонуклеазы А из поджелудочной железы теленка [217].

Для рибонуклеазы S пространственная структура определена с разрешением 0,35 нм [220, 221]. Результаты совпадают с моделью Карты. Найдено, что около половины S-пептида находится в виде о -спирали. Вся молекула содержит 15% спиральной и -75% /3-структуры. [c.403]

Животные лизоцимы состоят из одной полипептидной цепи, включающей 129 аминокислотных остатков, гомологичны между собой и, как и в случае рибонуклеазы, при участии 4 дисульфидных мостиков сворачиваются в характерные третичные структуры. [c.407]

В конце 1960 - начале 1970-х годов стали известны трехмерные структуры папаина, химотрипсиногена, а-химотрипсина, р-трипсина, эластазы, стафилококковой нуклеазы, рибонуклеазы и некоторых других белков. Во всех случаях ситуация коренным образом отличалась от миоглобина и гемоглобина. Перечисленные белки содержали не более, чем у лизоцима, и столь же нерегулярные а-спирали и р-структуры. [c.74]

В блочном методе определения последовательности нуклеиновых кислот весьма существенна методология структурного анализа. В одном из возможных вариантов используется полное расщепление полинуклеотидной цепи двумя (или более) ферментами с различной специфичностью. В случае РНК это может быть осуществлено различными рибонуклеазами, например гидролиз последовательно рибонуклеазой Т,, а затем — панкреатической рибонуклеазой. Структуры полученных олигонуклеотидов сравниваются для поиска перекрывающихся последовательностей Если это оказывается недостаточным, используется третья РНаза. [c.314]

Разделив продукты исчерпывающего или частичного гидролиза РНК с помощью рибонуклеазы, структуру большинства РНК устанавливают путем сравнения нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов. Каждый индивидуальный олнгорибонуклеотид подвергают частичному гидролизу с помощью менее специфичной рибонуклеазы (например, с помощью рибонуклеазы Тг), которая расщепляет все фосфоди-эфирные связи. Реакцию проводят в таких условиях, чтобы получить набор фрагментов, различающихся по длине на один нуклеотидный остаток. С помощью двумерной гомохроматографии на пластинках с DEAE-целлюлозой разделяют эти продукты и по характеристическому изменению подвижности укороченных на одно звено фрагментов судят о природе нуклеотидного остатка, который в исходном олигорибонуклеотиде занимал соответствующее положение. Таким образом можно прочитать всю хроматограмму и установить полную нуклеотидную последовательность данного олигорибонуклеотида [5, 128]. [c.190]

Примером может служить молекула рибонуклеазы, третичная структура которой фиксируется четырьмя дисульфид-ными мостиками (рис. 66). Если нативную (сохранившую свои природные свойства и, в частности, каталитическую активность) рибонуклеазу обработать мочевиной и меркаптоэта-нолом, то дисульфидные мостики разрываются — происходит денатурация с утратой биологической активности и изменением третичной структуры. После удаления реагентов, вызвавших денатурацию, рибонуклеаза под действием кислорода воздуха снова замыкает свои дисульфидные связи, принимая свойственную ей третичную структуру и вновь приобретая биологическую активность. [c.641]

Активный центр химотрипсина расположен в небольшом углублении, но оно не является ярко выраженной щелью[6], как в лизоциме или рибонуклеазе. Структура молекулы а-химотрипсина в области активного центра упакована относительно неплотно. Ароматический участок молекулы субстрата располагается на адсорбционном центре— впадине, имеющейся в молекуле фермента. Эта впадина образуется благодаря дисульфидной связи, замыкающей цикл из пятнадцати аминокислотных остатков. [c.120]

Блестяш,им примером определения структуры белка может служить усгановление строения рибонуклеазы, проведенное двумя группами исследователей— Муром, Штейном, Хирсом и группой Анфинсена. [c.521]

II деформации. Иногда (например, в случае рибонуклеазы) структура аналога очень близка к структуре природного субстрата. В редких случаях (для трипсина и триозофосфатизомеразы) положение равновесия между субстратом и продуктом таково, что оно позволяет установить структуру продуктивного комплекса. [c.345]

По мере расшифровки структуры различных белков (особенно в последние годы) становилось все более очевидным, что глобулярные белки, как и миоглобин, сохраняют свою структуру преимущественно благодаря взаимодействию между гидрофобными остатками. Внутри молекулы белка боковые группы уложены исключительно компактно. Если где-нибудь в структуре остается свободное пространство, оно обычно заполняется водой [24, 25]. Например, плотность упаковки (отношение объема, ограниченного вандерваальсовой оболочкой, к полному объему) молекул лизоцима и рибонуклеазы составляет 0,75 для сравнения укажем, что для плотно упакованных сфер теоретическое значение плотности упаковки равно 0,74. Полярные группы обычно находятся на поверхности, но иногда бывают утоплены внутрь, образуя водородные связи с другими группами внутри молекулы белка. На отдельных участках поверхности встречаются и неполярные боковые цепи, которые в ряде случаев сгруппированы в гидрофобные кластеры. Последние могут обусловливать взаимодействие с другими белками или с липидными участками мембран. [c.96]

Вот так и в Кембридже и за его пределами постепенно складывалось мнение, что от Фрэнсиса может быть настоящий толк. Хотя некоторые скептики все еще считали его хохочущим фонографом, тем не менее было ясно, что он способен доводить решение проблемы до финишной черты. Свидетельством роста его репутации было предложение, которое он получил в начале осени Дэвид Харкер пригласил его на год к себе, в Бруклин. Получив миллион долларов на раскрытие структуры фермента рибонуклеазы, Харкер подыскивал талантливых сотрудников, а. по мнению Одил, шесть тысяч долларов за один год — очень большие деньги. Как и следовало ожидать, Фрэнсис колебался. С одной стороны, про Бруклин рассказывали слишком много анекдотов, но, с другой стороны, он еще ни разу не был в Штатах, и даже Бруклин мог бы послужить отправной точкой для посещения более привлекательных мест. К тому же, узнав, что Крика не будет в лаборатории целый год, Брэгг скорее отнесется положительно к просьбе Макса и Джона оставить его в лаборатории еще на три года после окончания им диссертации. Во всяком случае, можно было дать предварительное согласие, и в середине октября Фрэнсис написал Харкеру, что приедет в Бруклин на следующую осень. [c.86]

Последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи создает первичную структуру белка она установлена в настоящее время для ряда природных белков. Осуществлен и синтез ряда белков, например инсулина (51 аминокислота), рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка). Синтезы подобного рода требуют последовательного осуществления сотен химических операций. Большую помощь оказывает при этом метод твердофазного синтеза, предложенный Мэрифильдом в 1963 г. полипептидная цепь постепенно наращивается на полимерном носителе (полисти-рольной смоле) и лишь после завершения синтеза снимается е носителя. [c.635]

Коммерческие препараты панкреатической рибонуклеазы негомогенны. Они состоят из двух основных компонентов Л и 5, с близкой структурой и свойствами, но различающихся по своей специфичности. На долю компонента Б обычно приходится от 10 до 20% от исходного препарата белка. Разделение фракций Л и осуществляют хроматографически на колонке с КМ-целлюлозой (или на амберлите IR —50/ХЕ-64). [c.113]

В нач. 50-х гг. была выдвинута идея о трех уровнях организации белковых молекул (К. У. Линдерстрём-Ланг, 1952)-первичной, вторичной и третичной структурах. Определены первичные структуры инсулина (Ф. Сенгер, 1953) и рибонуклеазы (К. Анфинсен, С. Мур, К. Хёрс, У. Стайн, 1960). По данным рентгеноструктурного анализа были построены трехмерные модели миоглобина (Дж. Кендрю, 1958) и гемоглобина (М. Перуц, 1958) и, т. обр,, доказано существование в Б, вторичной и третичной структур, в т. ч. а-спирали, предсказанной Л. Полингом и Р, Кори в 1949-51. [c.248]

Хим. синтез широко применяют для получения пептидов, в т. ч. биологически активных гормонов и их разнообразных аналогов, используемых для изучения взаимосвязи структуры и биол. функции, а также пептидов, несущих антигенные детерминанты разл. Б. и применяемьк для приготовления соответствующих вакцин. Первые хим. синтезы Б. в 60-е гг. (инсулина овцы и рибонуклеазы 5), осуществленные в р-ре с помощью тех же методов, к-рые используют при синтезе пептидов, были связаны с чрезвычайно большими сложностями. В каждом случае требовалось провести сотни хим. р-ций и окончательный выход Б. был очень низок (менее 0,1%), в результате чего полученные препараты не удалось очистить. Позже были синтезированы нек-рые химически чистые Б., в частности инсулин человека (П. Зибер и др.) и нейротоксин II из ядра среднеазиатской кобры (В. Т. Иванов). Однако до снх пор хим. синтез Б. представляет весьма сложную проблему и имеет скорее теоретич., чем практич. значение. Более перспективны методы генетической инженерии, к-рые позволяют наладить пром. получение практически важных Б, и пептидов. [c.253]

Ядра Н, N. С и О лежат в плоскости из-за резонанса, а связи находятся в гране-положении. Полимеры аминокислот меньших размеров, называемые олигопептидами, образуют в растворе хаотические спирали, но белки имеют более или менее фиксированную трехмерную структуру, удерживаемую водородными связями (разд. 14.8), связями —5—5— между остатками цистинов, а также ионными и вандерваальсовыми силами. Последовательности аминокислот многих белков и полные трехмерные структуры последних были определены с помощью дифракции рентгеновских лучей (гл. 19). Один белок — рибонуклеаза — был синтезирован в лаборатории двумя различными методами. В этом случае полипептид с остатком аминокислоты свертывается в правильную спираль и дает такую же трехмерную структуру, как нативный белок. [c.601]

В поджелудочной теленка помимо рибонуклеазы А присутствуют рибо-нуклеазы В, С и D. Эти ферменты относятся к гликопротеннам и имеют различное содержание углеводов. Напрнмер, рибонуклеаза В соединена через остаток аспарагина в положении 34 с пятью остатками маннозы и двумя остатками глюкозы. Для ряда рибонуклеаз, найденных в грибах и бактериях, определена структура, описан синтез рибонуклеазы Г], состоящей из 104 аминокислотных остатков. [c.404]

Самый ценный вывод, который был сделан на основании данных, полученных методом рентгеноструктурного анализа, состоит в том, что основной группой, отщепляющей протон от 2 -гидроксила, является Н1з-12, в то время как кислотная группа, отдающая протон уходящему 5 -кислороду, принадлежит Н1з-П9 [59]. (Любопытно, однако, что синтезированное производное рибонуклеазы с М -карбоксиметилированным остатком Н13-12 проявляет некоторую каталитическую активность — факт, в связи с которым возникает ряд вопросов [60].) Характер зависимости активности рибонуклеазы от pH согласуется с предложенным механизмом, поскольку найдены два значения р а (5,4 н 6,4), соответствующие двум группам, состояние ионизации которых контролирует активность фермента. (На основании ЯМР-спектров, показанных на рис. 2-42, было получено значение р/Са, равное 5,8.) Вблизи двух остатков гистидина расположен остаток Ьуз-41. Возможно, его положительный заряд используется для частичной нейтрализации отрицательного заряда на атомах кислорода фосфатной группы, облегчая атаку нуклеофильным агентом. С точки зрения химии рибонуклеазы интересен тот-факт, что под действием бактериальной пептидазы отщепляется фрагмент, содержащий двадцать аминокислотных остатков. Этот 5-пептид . Может воссоединяться с остальной частью молекулы с образованием активного фермента, называемого рибонуклеазой 5. Структура этого, фермента была определена методом дифракции рентгеновских лучей и по существу оказалась аналогичной структуре нативной рибонуклеазы. [c.121]

Нековапентные семисинтезы основаны на том факте, что различные белки после расщепления на фрагменты и их разделения прн рекомбинации образуют биологически активные нековалентные комплексы. Классический пример — рибонуклеаза А из поджелудочной железы быка (рис. 3-24), которая расщепляется бактериальной протеазой субтилизином на так называемые 5-пептид (1—20) и 5-белок (21—124), а после рекомбинации разделенных продуктов расщепления показывает полную ферментативную активность. Для рекомбинации с нативным 5-белком использовались аналоги 5-пептида, синтезированные химически, при этом были получены ценные данные по связи между структурой и функцией. [c.218]

По данным Рихардса [219], рибонуклеаза А при обработке бактериальной протеазой субтилизином расщепляется между остатками А1а-20 и Ser-21 на так называемый S-nenmud (1 — 20) и S-белок с последовательностью 21 — 124, содержащей 4 дисульфидных мостика. Оба компонента после разделения показывают ничтожную биологическую активность. Однако, если смешать их один с другим, биологическая активность восстановливает-ся, т. е. S-пептид и S-белок с помощью невалентных связей собираются в так называемую рибонуклеазу 5, обладающую пространственной структурой, близкой к нативной конформации. [c.403]

К середине 1940-х годов пептидная теория белков Фишера и Вальд-шмидт-Лейтца была почти повсеместно принята. Встал вопрос о точном знании деталей химического строения, т.е. о конкретном порядке расположения аминокислот в белковых цепях. Впервые такое сложное исследование удалось провести в течение десятилетия (1945-1954 гг.) ф. Сенгеру, определившему аминокислотную последовательность инсулина. Вторым белком была рибонуклеаза А. Полная структура этого фермента расшифрована С. Муром, К. Хирсом и У. Стейном (1960 г.). Вскоре идентификация химичекого строения белков стала производиться с помощью автоматических секвенаторов и приобрела рутинный характер. Однако достижения в решении первой фундаментальной задачи проблемы белка не принесли удовлетворения. Сначала не вызывало сомнений, что химические и физические свойства белков получат свое объяснение, как только станет известно химическое строение их молекул. Однако основанная на опыте всей органической химии и биохимии надежда на то, что установление химического типа и строения молекул окажется достаточным для понимания хотя бы в общих чертах их специфического функционирования, не оправдалась. Тем самым определение структуры из конечной цели исследования превратилось в необходимый для последующего изучения белков начальный этап. Утвердилась мысль, что химическая универсальность и практически необозримое многообразие свойств соединений этого класса при строгой специфичности его отдельных представителей связаны с особенностями пространственных структур белковых молекул. [c.67]

Прежде всего, можно более или менее определенно локализовать на первичной структуре РНК те нуклеотидные остатки или олигонук-леотидные районы, которые не участвуют в комплементарном спаривании и вероятнее всего представляют собой однотяжевые секции цепи. Эти районы особенно чувствительны к таким рибонуклеазам, как панкреатическая пиримидил-РНКаза А, грибная гуанил-РНКаза Tt, бактериальная РНКаза Si, и к модификации их оснований такими [c.71]

Особый интерес представляют, конечно, взаимодействия рибосомных белков с высокополимерными рибосомными РНК (16S и 23S РНК прокариот или 18S и 28S РНК эукариот), ибо они представляют собой основной ковалентный каркас и структурное ядро рибосомных субчастиц. По-видимому, больщинство рибосомных белков контактируют и так или иначе взаимодействуют с высокополимерными рибосомными РНК. Однако среди них можно выделить специальные сердцевинные РНК-связывающие белки, которые прочно взаимодействуют с соответствующей рибосомной РНК, более или менее независимо от других белков. Такими белками малой (30S) рибосомной субчастицы Е. соИ, независимо вступающими в комплекс с 16S РНК, являются S4, S7, S8, S15, S17 и S20. Каждый из них связывается только со специфическим местом на 16S РНК, узнавая его нуклеотидную последовательность и пространственную структуру. Эту последовательность можно выявить таким путем изолированный белок добавляется к рибосомной РНК, в результате чего образуется специфический белок-РНК-комплекс комплекс переваривается рибонуклеазой, так что негидролизованной остается лищь та часть нуклеотидной последовательности, которая закрыта белком эта защищенная последовательность определяется и, таким образом, идентифицируется. Другой метод локализации белков на первичной структуре рибосомной РНК — ковалентная сщивка (например, фотоиндуци-рованная) белка с РНК непосредственно в составе рибосомы, с последующим удалением несшитых белков, перевариванием РНК с помощью РНКазы и идентификацией сшитого олигонуклеотида. Расположение мест связывания вышеуказанных шести белков вдоль цепи 16S РНК схематически показано на рис. 59, а. Видно, что белки [c.100]

В глобулярных белках найдены несколько ц с-пептидов, цис-Связи обнаружены во многих циклических пептидах, в особенности со стороны N-конца перед остатками Pro [37, 38]. В глобулярных белковых структурах обнаружено только несколько ис-связей, например перед Рго-93 и Рго-114 в рибонуклеазе S [39], перед Рго-168 в субтилизине [40], перед Рго-116 в нуклеазе стафилококка [Е. Хазен, частное сообщение], перед Рго-8 и Рго-95 вариабельной цепи белка Бенс-Джонса [42] и между Ser-197 и Туг-198 в карбоксипептидазе-А [43]. Молекулы синтетического поли-L-Pro I содержат только цис-съяш. Таким образом, из всех типов стандартных а.минокислот Pro в наибольшей мере способствует образованию цис-чъязя, что согласуется с энергетическими расчетами. Однако, как правило, цис-съяш встречаются крайне редко. [c.35]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология