Электрофоретические методы отделения

Проведение электрофореза. Разделение можно проводить как в трубочках (с. 95), так и на пластинах для вертикального электрофореза (с. 97). После обработки ДСН к образцам добавляют сахарозу (до концентрации 10%) и в качестве лидирующего красителя — бромфеноловый синий (до концентрации 0,001%). Образцы исследуемых белков и белков-маркеров наносят на поверхность геля в объеме от 20 до 100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов) и осторожно наслаивают электродный буфер. Нагрузка на гель определяется методом окраски гелей, а также способностью того или иного белка связывать используемый краситель. Как правило, при электрофорезе в трубочках удается обнаружить от 20 до 100 мкг белка, при электрофорезе в пластинке — от 4 до 15 мкг. В электродный буфер катодного отделения добавляют ДСН до концентрации 0,1%. Электрофоретическое разделение проводят при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубочку. При этом сначала устанавливают силу тока - [c.120]

Электрофоретическое разделение НЬА и НЬ8 по методу подвижной границы показывает, что разница между зарядами этих молекул составляет один элементарный заряд на половину молекулы. Вполне возможно, что эта разница обусловлена заменой всего лишь одной аминокислоты в а- или р-цепи. Для того чтобы дать точный ответ, нужно было бы иметь данные полного анализа аминокислотной последовательности в обеих цепях. Однако установить участок, в котором два вида молекул гемоглобина различаются по аминокислотному составу, можно и без полного определения последовательности аминокислот. Протео-литический фермент трипсин гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы остатков лизина и аргинина. И лизин, и аргинин имеют сравнительно длинные неразветвленные боковые цепи с положительным зарядом на конце. В каждой половине молекулы гемоглобина на 287 аминокислотных остатков приходится около 26 остатков лизина и аргинина. Таким образом, трипсиновый гидролизат половины молекулы гемоглобина должен содержать около 28 пептидов (поскольку в каждой половине имеются две различные цепочки), каждый из которых содержит в среднем немногим больше 10 остатков. В действительности при таком гидролизе отщепляется устойчивое ядро , содержащее около четверти аминокислотного состава половины молекулы. Анализ состава этого ядра , отделенного центрифугированием от прочих пептидов, показывает, что в НЬА и в НЬЗ оно имеет одинаковый аминокислотный состав и, вероятно, одинаковую последовательность аминокислотных остатков. [c.223]

После электрофоретического разделения содержание элементов в зонах может быть оценено количественно одним из инструментальных методов, например, методом отражательной денситометрии, как это сделано в [10]. В этой работе тонкослойная электрохроматография была использована для отделения меди и цинка от кадмия на слое сорбента-носителя (толщиной 0,15 мм), состоящего из силикагеля КСК, закрепленного крахмалом. [c.131]

Электрофорез применяется главным образом при разделении белков 145, 46]. Различные макромолекулы в зависимости от их размера и заряда движутся в электрическом поле с разными скоростями. Распределение белков в электрофоретической ячейке обычно контролируют оптическими методами. Для препаративных целей фракции белков при электрофорезе собирают в различных отделениях ячейки. [c.164]

Как и другие аффинные методы, аффинный электрофорез основан на том, что поведение интересующего нас фермента изменяют путем введения специфического по отношению к нему лиганда. В данном случае под поведением понимается электрофоретическая подвижность. Существуют два возможных способа проведения такого электрофореза. Первый — включение заряженного лиганда в буфер, что приводит к повышению или снижению подвижности белка в зависимости от разницы между значениями его суммарного заряда в отсутствие и в присутствии лиганда. При препаративном электрофорезе в отсутствие лиганда происходит отделение группы белков с одинаковой средней подвижностью. Если подвергнуть такой образец повторному электрофорезу в присутствии лиганда, то нужный фермент должен отделиться от неспецифических белков (рис. 5.19). Однако это не более чем теоретические предпосылки. [c.224]

Разрушение аэрозолей, играющее столь большую роль во многих производствах как средство борьбы с ними, сводится к отделению вещества дисперсной фазы от дисперсионной газовой среды, т. е. процесс этот в основном является коагуляционным. Поэтому и методы борьбы с устойчивыми аэрозолями должны основываться на устранении действия стабилизирующих факторов. Но для коагуляции аэрозолей не может быть применен основной способ коагуляция, употребляемый для лиофобных золей,— действие электролитов-коагуляторов. Зато два других общих приема—взаимная коагуляции и электрофорез, особенно последний, находят широкое практическое применение. Так, на опыте удалось показать, что путем разбрасывания с самолета высокораздробленного и отрицательно заряженного песка на верхнюю, часть облаков можно вызвать коагуляцию последних, т. е. вызвать не что иное, как искусственный дождь. Что касается электрофоретического метода, то в соответствии с особенностями аэрозолей он принял здесь совершенно особый характер в технике он известен под названием метода Коттреля чтобы сообщить частицам достаточно большую скорость (с помощью электронной ионизации воздуха), напряжение постоянного тока доводят до 50000 в и более. [c.263]

Расчеты показали, что минимальные удельные приведенные затраты и стоимость очистки 1 м воды соответствуют скоростям фильтрования 0,03—0,05 м/ч. При экономической оценке метода, кроме электрофоретических аппаратов, были учтены выпрямители, пусковые устройства и приборы контроля, микрофильтры для предварительного отделения от воды крупной взвеси, установки типа ОВ-Ш с бактерицидными лампами для обеззараживания воды, здание водоочистной станции объемом 170 м . Стоимость электроэнергии принята равной 2,5коп. за 1 кВт-ч. [c.211]

Поскольку бромистый водород довольно плохо растворим в трифторуксусной кислоте, процесс отщепления проводят обычно, пропуская слабый ток безводного бромистого водорода в суспензию пептидил-полимера в трифторуксусной кислоте в течение 60— 90 мин. Отделение пептидов этим методом осуществляется превосходно. Так, при синтезе аналогов брадикинина выход очищенных пептидов составил 85% в расчете на первую аминокислоту, присоединенную к полимеру [128]. Выходы других пептидов колебались в пределах от 85 до 50%. Естественно, что выход снижается, если на какой-либо стадии реакция протекает неполно. Нельзя определять выход пептида после отщепления его от полимерного носителя по сухому весу неочищенного продукта, так как упомянутый реагент отщепляет от полимера также значительное количество непептидного материала, обычно нерастворимого в воде. Этим веществом непептидной природы, как правило, пренебрегают, поскольку его легко удалить любыми методами очистки. Хотя природа его подробно не исследована, можно предполагать, что это вещество представляет продукт разложения самого полимера. Было показано, что отщепление не вызывает перехода а-связи остатка аспарагиновой кислоты в ангиотензине в р-связь [65], хотя при получении одного пептида, содержащего связь остатка аспарагиновой кислоты с остатком серина, был получен в результате промежуточной циклизации р-аспарагиновый пептид [75]. Некоторые исследователи сомневаются в правильности и необходимости длительного отщепления. Почти все пептиды, которые можно отщепить от полимера, отделялись, в конечном счете, в первые несколько минут [30, 65] (см. стр. 88), а при отщеплении ангиотензина [65] в течение более 5 мин получали вещество, которое не расщеплялось лейцинаминопептидазой, хотя электрофоретически оно отличалось от р-аспарагинового пептида. Для отщеп- [c.34]

При мечении с использованием олигонуклеотидной затравки, как и в случае других методов получения проб с высокой удельной активностью, используют фрагменты ДНК, отделенные от вектора с помощью обработки рестриктазами и электрофоретического разделения в агарозе. Однако большое преимущество мечения с использованием олигонуклеотидов перед другими методами заключается в том, что перед мечением ДНК не требуется элюировать из агарозного геля. Вместо этого полосу, содержащую известное количество нанесенной на гель ДНК, локализуют с помощью хемископа и вырезают из геля. Кусочек геля взвешивают, рассчитывают в нем количество ДНК и аликвоту, в которой содержится только 10 нг ДНК, используют непосредственно в реакции. Перед мечением кусочек агарозы расплавляют на кипящей водяной бане (при этом ДНК одновременно денатурирует и выходит нз агарозы), затем его охлаждают до 37 °С и аликвоту, содержащую 10 нг ДНК, вно- [c.297]

Иммуноглобулины составляют группу макромолекул, чрезвычайно гетерогенную по биологической активности, заряду и молекулярному весу. Это наиболее щелочные из сывороточных глобулинов, обладающие наименьшей электрофоретической подвижностью (обзор Eisen, 1973). Для их отделения от остальных белков сыворотки используют либо обычные физико-химические методы, такие, как высаливание, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и препаративный зональный электрофорез, либо аффинную хроматографию последний метод особенно пригоден для выделения из сыворотки специфических антител. Все эти методы достаточно просты, не требуют большой затраты времени и обеспечивают хороший выход иммуноглобулинов. Иммуноглобулины разных животных различаются по заряду, молекулярному весу и электрофоретической подвижности, поэтому методы фракционирования, пригодные для выделения иммуноглобулинов одного вида, не всегда будут без каких-либо изменений пригодны для глобулинов другого вида в каждом отдельном случае необходима подработка методики. В этой главе дается краткое описание общих методов фракционирования, позволяющих выделять иммуноглобулины большинства видов животных. [c.58]

Большое преимущество этого метода — высокий выход антител в целом или отдельных иммуноглобулинов при фракционировании сывороток и возможность разделения двух или более видов антител, относящихся к одному классу Ig, но имеющих различную электрофоретическую подвижность. Кроме того, можно одновременно проводить электрофоретическое разделение нескольких образцов (Braun, Krause, 1968 Johansson, 1972). Однако в отличие от ранее упоминавшихся методов (хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрации) количество наносимого на гель материала здесь очень ограничено кроме того, эксперимент занимает много времени, но это окупается простотой отделения иммуноглобулинов от других белков и хорошей воспроизводимостью. [c.63]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология