Иммуноглобулины выделение

Полученный сорбент проверяют на примере хроматографии функции иммуноглобулинов, выделенной из сыворотки путем высаливания сульфатом аммония. Элюирование специфически сорбированных антител проводят, последовательно сменяя различные буферные растворы. С целью оценки эффективности полученного аффинного сорбента на каждой стад пт подсчитывают выход иммуноглобулинов. Для постепенной десорбции различных фракций [c.191]

Гель-фильтрация все шире используется для фракционирования белков сыворотки. Наиболее подходящим в данном случае является сефадекс G-200. С колонки этого геля белки сыворотки элюируются тремя пиками. Первый пик соответствует в основном липо-протеидам и макроглобулинам, вторым пиком выходит IgG, в третьем пике содержатся главным образом альбумин и трансферрин. В принципе гель-фильтрацию на G-200 можно использовать и для выделения иммуноглобулинов. [c.24]

Наиболее выпукло способность к узнаванию выражена у белков иммунной системы — уже упоминавшихся в 1.4 иммуноглобулинов, или антител. Иммуноглобулины определенной специфичности начинают активно вырабатываться организмом в ответ на появление чужеродного антигена и обладают способностью избирательно связывать именно этот антиген. Если в роли антигена выступает большая молекула, например молекула белка, то антитело опознает не всю молекулу, а некоторый ее участок, называемый антигенной детерминантой. Белковые молекулы обычно имеют серию антигенных детерминант, и уже по этой причине в ответ на появление в организме чужеродного белка вырабатывается целый набор антител, направленных на разные детерминанты. Более того, к каждой детерминанте вырабатывается, как правило, несколько различных иммуноглобулинов. Поэтому даже иммуноглобулины, специфичные к одному определенному антигену, представляют собой не индивидуальные белки, а смесь большого числа сходным образом построенных молекул. А так как организм непрерывно встречается с разнообразными антигенами, то фракция иммуноглобулинов сыворотки крови представляет собой смесь огромного числа различных антител, причем содержание каждого из них, как правило, очень мало. Трудность выделения индивидуальных иммуноглобулинов долгое время была препятствием для их биохимического исследования, в том числе для установления их первичной структуры. [c.38]

Аффинная хроматография высокоспецифичный и эффективный метод выделения специфических белков. Вследствие того что молекулы большинства белков легко разрушаются при использовании для их выделения и очистки многих традиционных методов, применяемых в органической химии, таких, как возгонка и экстрагирование различными растворителями, биохимики вынуждены были разработать для этой цели специальные методы. Нередко удается выделить какой-нибудь один белок, присутствующий в смеси, содержащей несколько тысяч других биомолекул, в концентрации 10 -10 М. Один из таких методов, известный под названием аффинной хроматографии, сыграл решающую роль при выделении и очистке ряда ферментов, иммуноглобулинов и рецепторных белков. В основе метода лежит тот [c.163]

При сопоставлении образцов свежего молозива и выделенных из него JgA оказалось, что JgA идентичны по величине молекул. Это послужило серьезным доводом в пользу того, что большие размеры JgA молозива нельзя объяснить полимеризацией в процессе выделения. JgA молозива и большинства других секретов содержит дополнительный секреторный компонент, отсутствующий в сывороточном JgA. Гель-фильтрацией в тонком слое сефадекса G-150 было показано, что он по своим размерам примерно соответствует димеру легких цепей иммуноглобулинов [35]. При изучении белков молозива свиньи Портер и сотр. [70] использовали тонкослойную гель-фильтрацию на сефадексе G-200 для оценки изменений в составе белков в первые четыре недели лактации. [c.266]

Свойства иммуноглобулинов Е при контакте с аллергеном образуются мостики, что сопровождается выделением БАВ, вызывающих аллергические реакции немедленного типа. [c.59]

Рис. 3-25. Р -Слой - это обычная структура участков глобулярных белков. Сверху показан включающий 115 аминокислот домен молекулы иммуноглобулина. Он состоит из двух 3 - слоев, уложенных наподобие сандвича, один из которых выделен цветом. Внизу более детально изображен соверщенный антипараллельный 3 -слой. Обратите внимание на то, что каждая пептидная группа образует водородные связи с соседними пептидными группами. 3 -Слои, встречающиеся в глобулярных белках, обычно несколько менее регулярны, чем показанная здесь

Эритроциты предварительно фиксируют формалином или глютараль-дегидом, а затем связывают их с гамма-глобулином, который выделяют из иммунных сывороток и очищают от других сывороточных белков. Связывание гамма-глобулина с поверхностью эритроцитов производят с помощью хлорида хрома. Для этого к 8 объемам дистиллированной воды добавляют 1 объем иммуноглобулинов, выделенных из иммунной сыворотки, 1 объем 50%-й взвеси формалинизированных эритроцитов и 1 объем 0,1 — 0,2%-го раствора хлорида хрома. Смесь оставляют на 10 — 15 мин при комнатной температуре, затем обрабатывают эритроциты, как при РНГА. [c.64]

Масс-спектр, полученный цосле перметилирования N-конце-вого пептида свиного иммуноглобулина (выделен Франеком, Прага), содержащего 22 аминокислотных остатка, показал, что он может быть смесью двух пептидов (А и В), имеющих частичную последовательность, представленную в табл. 3 [109]. [c.226]

В иммунологических исследованиях часто возникает необходимость в получении очищенных препаратов антител, т. е. антигенспецифичных либо неспецифичных иммуноглобулинов. Выделение неспецифичных иммуноглобулинов из сыворотки обычно проводят путем последовательного фракционирования белков, которое включает следующие этапы. [c.532]

В том же 1956 г. были обнаружены и внутривидовые различия в антигенных свойствах иммуноглобулинов кролика (Oudin, 1956). В этом случае аллотипы были обнаружены не с помощью аутоантител (агглютинаторов), а с помощью перекрестной внутривидовой иммунизации. Для этого иммуноглобулины, выделенные из сыворотки одного кролика, вводили другому кролику и, если между иммуноглобулинами этих двух животных существовали антигенные различия, то у кролика-реципиента вырабатывались антитела, специфически реагирующие с иммуноглобулинами кролика-донора. С помощью перекрестной внутривидовой иммунизации были обнаружены также и аллотипы иммуноглобулинов мыши и крысы, но здесь задача облегчалась наличием большого числа ин-бредных линий животных (Herzenberg, 1964 Рохлин и др., 1970). [c.42]

Несмотря на многообразие и высокую разделяющую способность методов, описанных в 7.1, они оказываются бессильными при решении задач по выделению индивидуальных компонентов из сложных биологических смесей. Уже отмечалось, что иммуноглобулиновая фракция сыворотки крови состоит из тысяч различных антител, которые весьма сходны по общей структуре, что не дает надежды разделить смесь на индивидуальные компоненты традиционными методами, основанными на различиях тех или иных физико-химических характеристик компонентов. Единственным заведомым отличием каждого индивидуального иммуноглобулина является его специфичное сродство к определенному антигену. То же самое имеет место в случае смеси мРНК, которые несущественно различаются по нуклеотидному составу. Тем не менее они имеют различные нуклеотидные последовательности и соответственно могут обладать селективным сродством к олигонуклеотидам или нуклеиновым кислдтам с комплементарными последовательностями. [c.246]

Основной метод выделения иммуноглобулинов является их фракционированное оса едение этшолом (по Е. Дж. Кону, 1945— 1946) на холоду при строгом контроле pH и ионной силы раствора. На процесс разделения белков сыворотки крови влияют следую- щие основные факторы концентрация белка, диэлектрическая постоянная раствора, концентрация этанола, изоэлектрическая. точка, pH, ионная хила раствфа, гешгератур . [c.588]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

В табл. 11.1 приведено также несколько примеров выделения вирусов. Наиболее часто используемыми аффинными лигандами являются связанные антитела, например выделение вируса алле-утской болезни на сефарозе с присоединенным иммуноглобулином Ig i из хронически инфицированных норок [67]. [c.137]

Первые прямые данные о перестройке ДНК в процессе развития В-клеток были получены в 1976 г. в экспериментах, в которых ДНК из ранних мышиных эмбрионов, неспособных к выработке антител, сравнивали с ДНК из клеток мышиной миеломы, вырабатывающих антитела. Эти два вида ДНК переваривали рестрикционной нуклеазой и полученные фрагменты гибридизо-вали с радиоактивными последовательностями ДНК, приготовленными путем копирования in vitro V- или С-последовательности молекул информационной РНК для L-цепей, выделенной из клеток миеломы (см. разд. 4.5.3). Как показали результаты этих опытов, специфические V- и С-кодирующие последовательности находились у эмбрионов в разных рестрикционных фрагментах ДНК, а в клетках миеломы-в одном и том же рестрикционном фрагменте (рис. 17-39). Таким образом, у зародыша, где гены иммуноглобулинов не экспрессируются, последовательности ДНК, кодирующие V- и С-области той или иной цепи, локализуются в различных участках генома между тем в клетке миеломы, где уже образуются цепи иммуноглобулинов, эти две последовательности соединены вместе. [c.37]

Непрямые данные были получены прн изучении антиидиотипнческнх антител. Как уже говорилось, можно получить антитела, которые узнают антигенные детерминанты антиген-связывающих участков других антител такие детерминанты называются идиотипами. Антиидиотипические антитела, способные реагаровать с антиген-связывающим участком растворимого антитела к некоторому антигену X, будут связываться не только с анти-Х-антитела-ми в растворе, но также и с В-клетками, имеющими на своей поверхности те же самые антитела (как рецепторы для антигена X). Неудивительно, что присоединение антиидиотипических антител к этим рецепторам на поверхности В-клеток может ингибировать способность В-клеток узнавать антиген X н отвечать на него. Было показано, что в некоторых случаях антиидиотипические антитела связываются с Т-клвткамн н тоже ингибируют их способность отвечать на антиген X (рнс. 17-55). Генетические исследования позволяют предполагать, что идиотипы, общие для рецепторов В- н Т-клеток, могут кодироваться генными сегментами, определяющими вариабельные области Н-цепей иммуноглобулинов. Антиидиотипические антитела были использованы для выделения малых количеств рецепторов нз плазматических мембран Т-клеток. Хотя эти рецепторы состоят нз полипептидов, сходных по размерам с обычными Н-цепями, они не реагируют с антителами к константным областям каких-либо известных Н- или L-цепей иммуноглобулинов. Эти данные наводят на мысль, что рецепторы Т-клеток могут представлять собой какой-то новый класс Н-цепей, кодируемый специальным набором генов константной области н, возможно, некоторыми генными сегментами, кодирующими Ун-области обычных антител Этой гипотезе противоречит то, что в экспериментах с нспользованнем техники рекомбинантной ДНК не удалось [c.51]

Октадекапептид, выделенный Франеком и сотр. [108] из триптического гидролизата Л-цепи свиного иммуноглобулина, был подвергнут [92] масс-спектрометрированию после ацетилирования N-конца с последующим перметилированием. Интерпретацией основных пиков в масс-спектре можно было определить последовательность десяти аминокислотных остатков с N-конца. Полученные результаты суммированы в табл. 2 и находятся в согласии с результатами, полученными независимо последовательной деградацией по Эдману. Масс-спектр также указал, что пептид содержит приблизительно эквимолекулярную смесь аланина и треонина во втором положении с N-конца. [c.226]

О некоторых индивидуальных антиуглевод-ных и м м у н о г л о б у л и н а X, выделенных при миэломе. Известны 6 индивидуальных иммуноглобулинов, осаждающих декстран. Три из них специфичны для связи (1 - 3) a-D-глюкопира-ноз и ингибируются нигерозой, 3 других направлены на (1 ->6)-a-D-глюкопиранозидные связи и ингибируются изомальтозой. [c.106]

Разработаны ионообменные концентрирующие цатроны для выделений иммуноглобулинов. Емкость по белку—до 20 мг/патрон. [c.182]

Если в качестве аффинного лиганда используется кофактор, согласно данным Лоу и Дина [57], очень важно, чтобы нативная конформация, кофактора сохранялась даже после его связывания. Это справедливо также в том случае, если аффинным лигандом является биологически активный белок. Он должен быть присоединен к носителю минимально возможным числом связей, так как при этом увеличивается вероятность сохранения нативной третичной структуры белка. В качестве примера приведем работу Куатреказаса по выделению инсулина [14] на колонке с сефарозой с присоединенными при pH 6,5 или 9,5 антителами к свиному инсулину. Как будет показано ниже, белок связывается с активированной бромцианом сефарозой посредством непротонированных аминогрупп. Снижение pH уменьшает число связавшихся групп. Различия в величинах pH в процессе присоединения приводят к тому, что первое производное (pH 6,5) характеризуется почти 80%-ной теоретически возможной емкостью по инсулину, в то время как у второго производного (pH 9,5) эта емкость равна только 7%. Поскольку общее содержание белка одинаково в обоих случаях, второе производное должно содержать иммуноглобулин, который не способен [c.11]

Рис. 12-25. Размеры и локализация каталитических доменов некоторых протеинкиназ, рассмотренных в этой главе. Во всех случаях каталитический домен (выделен цветом) состоит примерно из 250 аминокислотных остатков и имеет сходную аминокислотную последовательность это позволяет предполагать происхождение их всех от общего предшественника. Три представленные здесь тирозин-специфические киназы-трансмембранные белки-рецепторы, которые при связывании специфического внеклеточного лиганда активируются и фосфорилируют ряд белков внутри клетки (в том числе и самих себя) по остаткам тирозина. Обе цепи рецептора инсулина кодируются одним геном, продукт которого - белок-предшественник - расщепляется на две цепи, связанные дисульфидными мостиками. Внеклеточная часть рецептора PDGF, по-видимому, сложена в пять иммуноглобулиноподобных доменов - возможно, этот белок относится к суперсемейств> иммуноглобулинов (разд. 18.6.20). Регуляторные субъединицы А-киназы (см. рис. 12-27) и киназы фосфорилазы (см. рис. 12-31), в норме

Гибридный белок САТ-кальцитонин [20] (табл. 4.11) был сконструирован так, чтобы его можно было очистить субстрат-аффинной хроматографией. Когда обнаружилось, что гибридный белок находится в нерастворимом состоянии, стало очевидным, что этот подход неприемлем. Другие гибридные белки, приведенные в табл. 4.11, были также сконструированы с расчетом на очистку с помощью аффинной хроматографии. Для выделения составного белка -галактозидаза-Х использовали -aминoфeнил- -D-тиoгaлaктoзид (субстратный аналог -галактозидазы [27]) и белок А, специфически связывающийся с фрагментом F иммуноглобулина G [28]. Эти гибридные белки, синтезируемые в клетках Е. oli, растворимы метод их очистки описан в разд. 4.4. [c.113]

Знание того, где находится фитохром в растении, конечно,, помогло бы нам понять механизм его действия, и для получения этой информации было использовано несколько методов. Самые подробные данные о распределении фитохрома на уровне световой микроскопии получены нами с помощью метода иммуноцитохимии— с использованием антител, синтезируемых в организме животного после введения ему в кровь чужеродного белка. Кролики, которым вводят выделенный из растительной ткани фитохром, синтезируют антифитохромный иммуноглобулин. Это вещество после очистки специфически связывается с фитохромоМ в срезах растительной ткани. Присутствие здесь иммуноглобулина можно выявить благодаря связыванию другого его конца с ферментом пероксидазой, при действии которого на субстрат образуется нерастворимый окрашенный продукт. Распределение фитохрома в молодых побегах ячменя, выясненное этим методом, показано на рис. 11.15. [c.349]

Методом электрофореза с подвижной границей при использовании, как правило, буферных растворов с pH 8,4—8,6 белки плазмы можно разделить на 5 или 6 фракций альбумин и несколько групп глобулинов, обозначаемых какаг,а2-, Р и -гло-булины. С помощью данного метода на ранних этапах его развития были установлены многие важные свойства белков плазмы. Результаты этих исследований были суммированы в ряде обзоров [560, 1149, 1462]. Электрофорез с подвижной границей применялся также для проверки чистоты белков, получаемых в препаративных количествах для клинических целей. И до сих пор этот метод используется для тестирования выделенных из плазмы белковых фракций (следует сказать, что для контроля качества необходимы также и другие методы, такие, как ультрацентрифугирование или иммунохимический анализ). Так, например, согласно существующим стандартам (Комитет экспертов по биологической стандартизации при Всемирной организации здравоохранения, 1967), препараты иммуноглобулинов человека должны содержать не менее 90% глобулинов с электрофоретической подвижностью, не превышающей —2,8-10 см /В [c.328]

Опыты Ниссонова подтвердили это предположение. При работе с пепсином выделен один двухвалентный, антигенсвязываю-щий фрагмент. Часть молекулы IgG, соответствующая F -фраг-менту, полностью разрушается. Получение двухвалентного фрагмента иммуноглобулина обеспечено действием пепсина на дистальный конец шарнирной области. В результате N-концевая половина молекулы остается нехронутой. Такой двухвалентный фрагмент обозначают как F(ab>2. [c.54]

Для понимания многих биологических явлений необходимо выделение субпопуляций клеток, находящихся на различных стадиях дифференцировки и в различных формах специализации. Разделение клеток особенно важно для изучения иммунной системы, состоящей из множества клеток, обладающих специфическими фенотипами и функциями. Основные методы основываются на наличии специфических компонентов на поверхности выделяемых клеток, например рецепторов лектинов, антигенов, иммуноглобулинов. Их развитию в большой степени способствовала возможность получения моноклональных антител против детерминант клеточной поверхности. [c.243]

Розеточные методы [4—8] фиксация антимышиных иммуноглобулинов на эритроцитах быка (с помощью хлорида хрома) и обработка в розетках выделяемыми клетками, предварительно покрытыми специфическими моноклональными антителами (продуцируемыми мышиной гибридомой) выделение связавшихся клеток достигается селективным лизисом эритроцитов. [c.247]

Предварительные результаты подтверждают, что процесс, заключающийся в иммобилизации антител против иммуноглобулинов мыши на мерсалил-трисакриле и выделении клеток, предварительно покрытых специфическими моноклональными антителами мыши, может применяться как общий метод. Этот процесс, уже использованный в чашечных методиках , требует лишь небольших количеств указанных моноклональных антител (Бонафо и др., неопубликованные данные). Этот метод имеет хорошие перспективы использования для разделения подгрупп специфических клеток и выделения антигенспецифических лимфоцитов. [c.259]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология