Коллекторы белковых фракций при

Для элюции адсорбированных белков с колонки используют солевые растворы, имеющие различные концентрации и значения pH. Если изменение концентрации солевого раствора осуществляется в процессе снятия белков с одной и той же колонки, такую элюцию называют градиентной. Элюат собирают небольшими порциями (по несколько миллилитров) в отдельные пробирки при помощи специальной установки—коллектора (сборщика) фракций. Таких проб в процессе фракционирования белков на колонке хроматографическим методом получают обычно несколько сотен. В результате проведения цветной реакции на белок или путем измерения поглощения каждого раствора в ультрафиолетовой области спектра устанавливают содержание белка в каждой пробе. По этим данным строят кривую, из рассмотрения которой становится ясным, сколько фракций белка содержится в элюате и в какой серии пробирок находится каждая фракция. Одноименные пробы объединяют и из полученного раствора выделяют чистый белок. [c.30]

Техника фракционирования белков на колонках обычно следующая. Белок (фермент и сопутствующие ему протеины), адсорбировавшийся вверху колонки, элюируют растворами, чаще всего содержащими возрастающие количества солей. Для этого используют буфера возрастающей концентрации или в слабом буферном растворе постепенно увеличивают концентрацию элюирующей соли, хлористого натрия и др. Иногда элюция осуществляется за счет постепенного изменения pH. При этих изменениях раствора, проходящего через колонку, сродство к адсорбенту фермента и иных белков все время снижается. Белки постепенно смываются, переходят в раствор, вытекающий из колонки. При помощи автоматического коллектора фракций его собирают небольшими порциями. В каждой из таких фракций определяют содержание белка и величину активности фермента, которые показывают графически (рис. 18). [c.150]

Промывание колонки фосфатным буфером проводят до тех пор, пока в отбираемых на коллекторе фракциях не останется даже следов белка (оптическая плотность растворов при определениях на фотоэлектроколориметре будет не выше 0,02). После этого начинают элюирование белков. [c.63]

Для белков большинство детекторов регистрирует поглощение УФ-света или флуоресценцию. Имеются разнообразные ультрафиолетовые детекторы, работающие в сканирующем режиме, а также детекторы с изменяемой или фиксированной длиной волны. Коллектор фракций для ВЖХ должен работать достаточно быстро, чтобы успевать за высокой скоростью элюции имеется много типов пригодных для этих целей коллекторов фракций. [c.139]

Эту операцию производят через нижнее, снабженное краном отверстие в следующей последовательности. Отключают напряжение и, подняв клапан, запирают электролит в центральной трубке. Во избежание подтекания его лучше из трубки отсосать. Из рабочего объема колонки сверху отсасывают верхний электродный буфер и до предела заполняют верхнюю часть колонки водой. Затем к отростку, ведущему в рабочую камеру, плотно присоединяют выходную трубку перистальтического насоса н открывают сливной кран. Жидкость из колонки будет вытекать только по мере подачи воды от перистальтического насоса в верхнюю часть камеры. Скорость этой подачи можно регулировать. Фирма рекомендует опоражнивать колонку со скоростью 60—80 мл/ч. Элюат из колонки через денситометр направляют в коллектор фракций. Во фракциях измеряют pH (при температуре фокусирования ). Если ультрафиолетовое поглощение оказывается недостаточным, наличие белков во фракциях определяют в аликвотах с помощью окрашивания или других описанных выше методов обнаружения белков. Отобранные фракции объединяют и отделяют в них белки от амфолинов. [c.70]

Препарат диэтиламиноэтилцеллюлозы емкостью 0,6—0,7 м-экв г получали по методу Петерсона и Собера [3]. Аминоэтилцеллюлоза — продажный препарат фирмы Ватман . Хроматографирование осуществляли на колонках диаметром 1,5 см при высоте столбика целлюлозы 15— 20 см путем пропускания буферного раствора с непрерывно повышающейся концентрацией хлористого натрия. Градиент выпуклой формы создавали при помощи смесителя. Скорость тока жидкости 10—15 мл/час. Фракции объемом 5—6 мл собирали на автоматическом коллекторе. Во фракциях определяли концентрацию белка (по величине оптической плотности при 280 м х), протеолитическую активность — расщеплением гемоглобина по модифицированному методу Ансона [4], створаживающую активность — описанным ранее методом [1]. В качестве стандарта использовали высокоочищенный препарат пепсина свиньи. [c.275]

Основные научные работы Мура, которые он проводил совместно с У. X. Стайном, посвящены исследованию строения белков. Они разрабатывали точные аналитические методы для определения аминокислотного состава белков. Развили (1951) метод ионообменной хроматографии, который применили для выделения и очистки рибонуклеазы. Благодаря сочетанию хроматографических методов анализа, разработанных Муром и Стайном, с предложенным ими фотометрическим нингидринным методом и их же автоматическим коллектором фракций они создали методику, позволяющую анализировать белковый гидролизат в течение двух недель. Применение синтетических ионообменных смол (сульфокатионитов) позволило им сократить (1950-е) это время до недели. Затем (1958) процесс ими был автоматизирован, а время анализа уменьшено до нескольких часов. Мур и Стайн установили [c.347]

После полного гидролиза белка производится количественное онределе-ние каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате. Для разделения аминокислот чаще всего применяется метод ионообменной хроматографии. В качестве ионообменника обычно используют сульфополистирольный катионит. Смесь аминокислот вносится в верхнюю часть колонки при pH 3 в этих условиях индивидуальные аминокислоты полонштельно заряжены. Аминокислоты в форме катионов сорбируются на сульфополистирольной смоле (содержащей группы — SOg Na ), замещая часть ионов натрия, и удернги-ваются на материале колонки электростатическими силами. Очевидно, что прочность сорбции аминокислоты возрастает с увеличением ее основности. После внесения смеси начинается элюция аминокислот при постепенном увеличении pH и 1тонной силы буферных растворов, пропускаемых через колонку. В этих условиях положительный заряд на аминокислотах постепенно нейтрализуется и ионные взаимодействия ослабляются. Первыми с колонки снимаются кислые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислота), затем нейтральные и, наконец, основные. С помощью этого метода можно разделять все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках, поскольку прочность сорбции аминокислоты смолой зависит как от ионных, так и от неионных взаимодействий. Сульфополистирольный катион адсорбирует аминокислоты достаточно избирательно, так что все нейтральные аминокислоты, которые нельзя разделить с помощью ионного обмена, тем не менее элюируются с колонки в разных фракциях. Индивидуальные аминокислоты, элюируемые с колонки, собираются автоматическим коллектором фракций. Затем их количественно определяют путем измерения интенсивности окраски, возникающей при действии нингидрина. В настоящее время промышленность выпускает несколько типов автоматических амино- [c.57]

Рассмотрим возможность автоматизации хроматографического анализа ферментов на примере, заимствованном из статьи [42]. Авторы статьи провели хроматографическое разделение ферментов на автоматическом анализаторе фирмы Te hni on (рис. 8.22). В этом приборе используется пропорциональный насос Р с 12 пластмассовыми трубками различного диаметра. Буферный раствор из системы формирования градиента прокачивается в колонку через трубку 1. Разделение белков происходит в колонке К. Основная часть элюата из колонки поступает в коллектор фракций F и затем используется после окончания анализа. В процессе хроматографирования от основного потока элюата отделяется очень небольшая часть, которая поступает в три аналитические секции, где проводится определение основной фосфатазы, трансаминазы и всех белков. После определения основной фосфатазы часть элюата поступает через трубку 2 вместе с пузырьками воздуха, введенными через трубку 3, и субстратом из трубки 4 в аналитическую систему. В короткой стеклянной спирали М происходит тшательное смешивание водных растворов, полученная смесь проводится через термостат I, в котором при определенных условиях происходит расщепление субстрата. Чтобы реакция прервалась, к смеси через трубку 5 добавляется раствор соответствующего реагента. Через смесительную спираль результирующая смесь вводится в проточную кювету колориметра С и затем идет на оброс. Сигнал детектора записывается самописцем Z, фиксирующим концентрацию основной фосфатазы (I). На абсциссу наносятся номера фракций. Определение трансаминазы проводится аналогичным образом. Через трубки 6—9 подаются образец, воздух, субстрат и реагент соответственно. Окончательный продукт реакции проходит через колориметр Сг. Результирующая концентрация трансаминазы пропорциональна кривой III записываемой самописцем. Третья аналитическая система, регистрирующая суммарное содержание белков, несколько проще, чем две другие. Часть элюата поступает через трубку 10, воздух проводится через трубку 11, а реагент для обнаружения белков — через трубку 12. Растворы смешиваются в спирали М, полученная смесь поступает в проточную ячейку колориметра Сз. Содержание белков в смеси записьгеается в виде кривой II. [c.80]

Через колонку пропускают буферный раствор pH 3,25, содержа-ш,ий BRIJ-35 (и в случае надобности—тиодигликоль), а через рубашку колонки — воду, нагретую до 50°. Исследуемый раствор должен иметь pH от 2,0 до 25 оптимальная нагрузка колонки составляет 0,5—1,0 мкмоль аминокислот, или 1—2 мг гидролизованного белка в объеме 2 мл. Раствор наносят на верхний конец колонки пипеткой с изогнутым концом и вводят в смолу пропусканием трех небольших порций буферного раствора pH 2,2. Затем наслаивают несколько сантиметров буферного раствора pH 3,25, колонку укрепляют над коллектором фракций и собирают элюат фракциями по 2 мл (фиг. 32). [c.72]

Недостатки непрерывной элюции заключаются в том, что белни (особенно движущиеся более медленно) элюируются в разбавлен 10М виде и что некоторые из них адсорбируются на трубках, по которым элюат поступает к регистратору поглощения ультрафиолетового света и коллектору фракций. Страух [1239] создал прибор, который одновременно регистрирует ультрафиолетовое поглощение и управляет скоростью элюции, вследствие чего устраняется разведение выходящих из колонки веществ. Описана также [811] методика элюирования белков при помощи буфера, циркулирующего по заранее заданной программе. [c.121]

Обычно для завершения ИЭФ достаточно 24—72 ч, после чего электродный клапан закрывают и содержимое колонки фракционируют через выводящий капилляр, не допуская смешивания полученных зон. Положение сфокусировавшихся белков можно регистрировать, измеряя. их поглощение в фотометре с проточной кюветой, соединенном с соответствующим самописцем. Величину pH отдельных зон, собранных вручную ИЛ1И с помощью. коллектора фракций, определяют на рН-метре. Поскольку изоэлектрические точки белков и окружающих их амфолитов должны быть одинаковыми, измеренная. величина pH каждой данной фракции соответствует изоэлектрической точке содержащегося в ней белка. При этом надежность полученных данных существенно зависит от объема фракций и чувствительности использованного рН-метра. [c.133]

Годоон [444] исггользовал для ИЭФ в градиенте плотности трубки с припаянными боковыми отводами (рис. 55). Такие J-образные трубки помещают в стандартный прибор для диск-электрофореза. Верхнюю часть трубки, содержащую градиент плотности, вставляют, как обычно, в верхний электродный сосуд, а боковой отросток, заполненный этилендиамином и 50%-ным раствором сахарозы, погружают в нижний электродный сосуд. После завершения ИЭФ в колонку снизу накачивают насооом раствор с высокой плотностью, вследствие чего весь градиент плотности поднимается вверх и вытесняется сначала в анализатор (фирма IS O, США), а затем, в коллектор фракций. Описанное устройство позволяет разделять 0,1—1 мг белков в градиенте объемом 10 мл. Помимо простоты конструкции еще одно важное преимущество данного прибора состоит в том, что он дает возможность исследовать одновременно несколько образцов при идентичных условиях. [c.135]

Постоянную скорость элюирования задают с помощью перистальтического насоса. Элюат, собираемый на фракционном коллекторе, анализируют в потоке или выборочно по фракциям на содержание белка, для чего обычно регистрируют изменение оптической плотности при 280 нм. Другие методы детектирования используют при отсутствии в белке хромофоров (остатков триптофана и тирозина), при работе иа микроуровне или при слишком высоком поглощении при 280 нм, например благодаря присутствию кофактора. В этих случаях можно определять оптическую плотность при 220 им, интенсивность флуоресценции или радиоактивность (при работе с мечеными белками) [14, 161] наконец, при анализе белковых фракций можно использовать химическую модификацию (разд. 1.4.5.1). Например, определенные объемы (аликвотные части) отдельных фракций можно подвергнуть щелочному гидролизу и последующему анализу по реакции с нингидрином. Для обнаружения белков можно использовать реакцию Лоури или реакцию связывания кра-снтеля. Последний метод вполне можно рекомендовать как наиболее простой и чувствительный, причем этому определению не мешает присутствие химических реагентов. Кроме того, состав фракций можно определять с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.23]

Зоны, представляющие интерес, вырезают и белок выделяют экстракцией [49, 64] или элюированием в условиях электрофореза [2, 175]. При определении аминокислотного состава приготовленных таким способом образцов обязательно вводят необходимые поправки, учитывающие присутствие акриламид-ного геля [26]. Согласно другому варианту, белки разделяют электрофорезом в блоке акриламидного геля, при этом под действием электрического поля белковые фракции попадают в проточную камеру, откуда и вымываются раздельно потоком элюэнта. Ход элюирования регистрируют с помощью проточного денситометра, элюат собирают на фракционном коллекторе. Недавно разработана методика элюирования белков из системы ПААГ —ДСН в промежуточный гель с использованием восходящего электрофореза [121]. Выход достигается высокий, однако образец может содержать примеси компонентов акриламидного геля и буферной системы. Гели для препаративного электрофореза могут иметь форму столбиков (LKB) или пластин (блоков) (Biorad). Для разделений по описанной методике 1 сп()льзуют различную аппаратуру, выпускаемую фирмами. [c.39]

Раствор диализованного белка наносят на колонку и дают ему впитаться в слой целлюлозы. Элюцию ведут стартовым буфером и собирают фракции, составляющие около половины объема раствора, нанесенного на колонку. Удобно пользоваться коллектором, регистрирующим УФ-поглощение, однако это не обязательно. После элюции первого пика белка, в котором содержится фракция IgG с более основными свойствами, стартовый элюирующий буфер заменяют смесью его с 0,05 М Na l (pH 7,5) и собирают второй пик, содержащий кислый IgG. [c.166]

В заключение упомянем о своеобразной конструкции колонок для ИЭФ в градиенте плотности раствора сахарозы, разработанной фирмой IS O (модель 212), Конструкторы этой фирмы стремились предоставить экспериментатору возможность следить за миграцией белков в ходе их фокусирования путем периодического сканирования всего градиента при 280 нм. На самой рабочей колонке это сделать не удается ввиду необходимости заключить ее в охлаждающую рубашку. Было найдено оригинальное, хотя и довольно сложное решение проблемы. Накачивая снизу в колонку плотный раствор сахарозы, ее содержимое, т. е. весь градиент pH, периодически поднимают в присоединенную сверху к колонке кварцевую трубку того же диаметра. При этом весь градиент последовательно проходит мимо облегающего эту трубку узла УФ-денситометра, для которого небольшой участок трубки играет роль цилиндрической кюветы. Затем весь столб жидкости возвращается обратно в колонку. Электрическое напряжение на рабочую колонку подается через расположенные по ее концам цилиндрические мембраны. На время сканирования напряжение выключается. Содержимое колонки элюируют в коллектор фракций также путем выдавливания градиента вверх. Объем колонки (охлаждаемой только снаружи) — 23 мл, а максимальная загрузка может составлять 10 мг белка. Все эти дорогостоящие усложнения не кажутся достаточно оправданными судя по публикациям последних лет, колонки IS O широкого распространения яе получили, [c.74]

Обнаружение полос (зон, пиков) в случае достаточной концентрации в них белков или нуклеиновых кислот нередко ведут по поглощейию света в ультрафиолетовой области спектра. Для частиц иногда удается регистрировать мутность в диапазоне длин волн 500—600 нм. Желательно, чтобы трубки, идущие от пробирки с градиентом к проточной кювете денситометра и, далее, к коллектору фракций, во избежание смещивания градиента в них были по возможности короткими и тонкими. Объем проточной кюветы также должен быть небольшим. Движение жидкости по кювете и трубкам должно происходить снизу вверх — опять-таки во избежание образования участков обратного градиента , где более плотная жидкость окажется над менее плотной. Разумеется, это справедливо для тех случаев, когда фракционирование градиента начинают от мениска. В случае отсасывания со дна пробирки, наоборот, жидкость в трубках и кювете должна течь сверху вниз. [c.222]

Горизонтальный блочный электрофорез не нашел широкого применения, несмотря на то что он не нуждается в сложной аппаратуре. Вертикальный колоночный электрофорез, особенно-в геле, используется значительно чаще. В отсутствие геля есть два способа стабилизировать жидкость в колонке они используются также при изоэлектрическом фокусировании и изотахо-форезе (см. разд. 5.3). Один из них основан на том же принципе, который используется в горизонтальных системах, — это заполнение большей части объема колонки инертным порошком,, так что миграция белка происходит в эффективном объеме между частицами. Второй способ заключается в гравитационной стабилизации жидкости с помощью градиента плотности сахарозы. Плотный раствор сахарозы помещают на дно колонки, а поверх него наслаивают раствор с равномерно убывающей плотностью, так что в верхней части колонки, куда вводят образец, концентрация сахарозы равна или почти равна нулю. Следует отметить, что сахароза в колонке лишь стабилизирует жидкость, сводя к минимуму конвекционные токи. Она лишь немного влияет на миграцию белка вследствие увеличения вязкости по мере перемещения белка вниз по колонке. Это замедляет движение белка, но вместе с тем снижает его диффузию. Обычный способ удалить белок из колонки после электрофореза — это просто дать жидкости стечь и собрать ее в виде фракций с помощью коллектора. Эту операцию нужно делать медленно, чтобы не перемешать отдельные зоны белка, движущиеся вниз по колонке. [c.220]

Анализ распределения разделенных компонентов в собранных фракциях проводят с помощью методов, позволяющих специфически обнаруживать разделяемые соединения. Очень часто все фракции, число которых может превышать 100, приходится исследовать вручную. Однако, если соединение обладает какими-либо характерными физическими свойствами, например поглощает свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра, выходящий из колонки элюат можно исследовать на содержание в нем данного соединения с помощью соответствукяцего прибора. Этот метод широко используется при анализе белков и нуклеиновых кислот, поглощающих свет при 280 и 260 нм соответственно. В этом случае элюат отводят из колонки с помощью капиллярных трубок в кварцевую проточную кювету, на которую падает луч света соответствующей длины волны. Изменения поглощения растворов регистрируют фотоэлементом и фиксируют на диаграммной ленте самописца, который можно синхронизировать с коллектором фракций. Таким образом, осуществляется непрерывная запись номеров фракций и количества содержащегося в каждой из них вещества. [c.109]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология