Векторы для клонирования ПЦР-фрагментов ДНК

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДНК в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помощью одного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

Клонирование фрагментов ДНК от 100 т. н. п. и более осуществляют в специально сконструированных векторах ВАС и YA . [c.41]

Клонирование фрагментов, полученных путем механического дробления, сопряжено с рядом технических трудностей в вектор легче встроить рестрикт. Однако сложность такого встраивания состоит в том, что сайты рестрикции могут находиться в неудобных местах, например в середине гена, который надо клонировать. Один из способов преодоления этой трудности состоит в использовании более чем одной рестриктазы, т.е. в повторении эксперимента с различными ферментами, сайты узнавания которых занимают разные положения. Но это требует дополнительного времени, и при работе с длинной последовательностью бывает сложно найти фермент, не разрезающий ее. [c.243]

Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т.п.н., клонированного на фаговом векторе. Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмент ДНК, радиоактивно меченный ( Н) с помощью ник-трансляции. Пред- [c.314]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

Благодаря использованию клонированных фрагментов установлена хромосомная локализация многих генетических нарушений, для которых не удавалось выявить недостаточности по каким-либо специфическим белкам. К таким заболеваниям относятся хорея Гентингтона (хромосома 4) муковисцидоз (хромосома 7) поликистозная нефропатия взрослых (хромосома 16) мышечная дистрофия Дюшенна (X-хромосома). Если область ДНК, в которой локализован дефект, имеет характерную структуру гена (рис. 36.1), то можно синтезировать этот ген, ввести в соответствующий вектор, добиться экспрессии и изучать функцию. Кроме того, можно синтезировать олигопептид, последовательность аминокислот в котором определяется согласно установленной открытой рамке считывания в кодирующей области. Антитела, полученные против этого пептида, представляют собой инструмент для выявления экспрессии данного пептида (или констатации ее отсутствия) у здоровых и больных людей. [c.46]

Бактериофаги широко используют в качестве векторов для клонирования фрагментов ДНК и введения определенных генов в промышленные бактерии. [c.214]

Часто бывает необходимо получить мутацию в фаговом геноме какого-нибудь вектора или клона, не прибегая к скрещиваниям, которые могли бы внести нежелательную чужую информацию (например, сайты рестрикции). С другой стороны, часто бывает нужно получить мутации в клонированной чужеродной ДНК. Для этого используется та же самая методика нужно лишь, чтобы функционирование встроенной ДНК приводило к такому фенотипу, который можно выявить. Мутации фага X используются как внешние маркеры при скрещиваниях, проводимых при картировании мутаций в клонированном фрагменте, или как такие маркеры, которые дают уверенность, что рекомбинация произошла внутри клонированного фрагмента. [c.36]

Первые эффективные векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК, не утратившие своего значения и поныне, были получены с использованием бактериальных плазмид. И се- [c.68]

Первый плазмидный вектор был получен С.Коэном (1973). Его источником была плазмида Е. соИ Rfi 5 с Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур. Особое место в генетическом манипулировании занимает плазмида, относящаяся к группе колициногенных плазмид Е. соИ. ol El реплицируется независимо от хромосомы и присутствует в количестве примерно 24 копий на клетку. Ее широко используют благодаря селективному маркеру в качестве вектора для клонирования фрагментов про- и эукариотической ДНК в Е. соИ. [c.118]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Как уже упоминалось, чаще всего в качестве матрицы для анализа используются фрагменты ДНК, клонированные в одноцепочечных фагах. Для унификации анализа последовательности любых фрагментов, клонированных в составе данного фага-вектора, можно использовать одну и ту же затравку. Для этого затравка должна быть комплементврна ие клонированному фрагменту, а (- -)-цепи фага вектора в том ее месте, которое граничит с З -концом клонированной вставки (рис. 185). В качестве затравок чаще всего используются синтетические олиго- и дезоксирибонуклеотиды. Для исключения деградации затравки с 5 -конца в качестве ДНК-полимеразы применяется обычно фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. oli. [c.328]

Клонирование всего генома (в противоположность клонированию специфических фрагментов) часто называют шотган -экспериментами (shotgun experiment-метод дробовика). Для их осуществления весь геном разделяют на фрагменты удобного размера. Затем фрагменты встраивают в клонирующий вектор с образованием популяции химерных векторов. Набор таких клонированных фрагментов называют библиотекой генома. Библиотека, однажды полученная с помощью фагового или плазмидного вектора (чаще-фагового вектора, поскольку в таком виде легче хранить необходимые большие количества химерных ДНК), может храниться неограниченно долгое время и при появлении нового зонда быстро может быть использована для поиска специфического фрагмента. [c.243]

В качестве таких векторов для клонирования (или клонирующих векторов) любых фрагментов чужеродной ДНК используются фаг X и множество различных плазмид. Вектор с клонируемым фрагментом ДНК может проникнуть в клетку Е. соН после того, как клетка обработана ионами Са Такая процедура позволяет конструировать штаммы бактерий, несущих определенные фрагменты чужеродной ДНК (клоны), и размно- [c.276]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Клонирование фрагментов генома, содержащих ОРС, в экспрессирующих векторах позволяет нарабатывать для иммунизации большие количества чистого белка. Это делает получение моноклональных антител к белкам, кодируемым последовательностями ОРС, стратегически простой, хотя и в некоторой степени трудоемкой задачей. Основные требования при подобной работе— наличие хорошей культуры клеток и использование высокочувствительного метода анализа, позволяющего отличать антитела к продуктам ОРС от антител, узнающих векторные фрагменты гибридного белка. Отлаживание такого метода— основное узкое место рассматриваемого подхода. После получения специфических моноклональных антител к продукту, кодируемому встроенным фрагментом, их можно использовать для выявления, количественного анализа и очистки белкового продукта ОРС. [c.180]

Клонированные фрагменты ДНК отделяют от вектора с помощью рестриктазной обработки и последующего препаративного электрофореза в агарозном геле. Препараты ДНК, предназначенные для микроинъекции, не должны содержать каких-либо вредных примесей, токсичных для яйцеклетки, а также твердых частиц, которые могут закупорить просвет микроиглы. Адекватный метод очистки ДНК описан в табл. 10.10. [c.343]

Часто у экспериментатора возникает потребность клонирования фрагмента ДНК, полученного расщеплением одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт расщепления для другой рестриктазы. С этой целью щироко применяются короткие синтетические двуспиральные олигонуклеотиды, имеющие в своем составе сайты узнавания для одной или нескольких рестриктаз. Такие олигонуклеотиды называют линкерами или поли/шнкерами (см. рис. 27) соответственно. " [c.142]

У плазмид на основе репликона olEI есть и недостатки. Одним из них является снижение числа копий на клетку при увеличении молекулярной массы гибридной плазмиды. Для плазмид этого типа выход рекомбинантов падает с ростом молекулярной массы вставки. Это обстоятельство делает малоэффективным клонирование в плазмидах фрагментов ДНК, превышающих 10 Т.П.О. Для клонирования фрагментов большей длины используют фаговые векторы, космиды и фазмиды. [c.146]

Векторы на основе фага Я особенно удобны для создания клонотек, но мало приспособлены для тонких манипуляций с клонированными фрагментами ДНК. Обычно для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК после их обнаружения в клонотеке переклонируют в плазмидные векторы. [c.149]

После знакомства с различным типом векторов приведем пример современного унивёрсального вектора для клонирования чужеродной ДНК (рис. 27). Он содержит сильные промоторы фагов ТЗ и Т7. Эти промоторы были синтезированы химически с наименьшей гомологией между ними для предотвращения образования шпилечных структур. Вставка любого фрагмента ДНК в полилинкер эффективно транскрибируется под контролем промотора фага Т7 или ТЗ (в зависимости от ориентации клонированного фрагмента). [c.153]

Использование фаговых векторов открывает большие перспективы для клонирования генов биосинтеза антибиотиков с помощью метода мутационного клонирования. Сущность метода заключается в возникновении мутантов, не способных к синтезу антибиотика (Ant ) при включении ДНК фага по гомологии с клонированным фрагментом в структурную часть гена(ов) ant реципиентного штамма, в результате нарушения их целостности. Фаговое потомство мутантных штаммов, образуемое при вырезании профага по фланкирующим гомологичным повторам, содержит в составе фаговых геномов клонируемый фрагмент с геном ant или частью этого гена (К. hater, С. Brutan, 1983). [c.168]

Это чуть ниже температуры плавления самой легкоплавкой области во фрагменте ДНК- Двухцепочечная молекула ДНК входит в гель и продвигается в нем со скоростью, пропорциональной ее молекулярной массе. Как только фрагмент достигает участка геля, в котором температура камеры и концентрация денатурирующих веществ создают условия для плавления первой, самой легкоплавкой области (домена), он как бы разветвляется одна часть его остается двухцепочечной, а другая переходит в одноцепочечную форму. Такая разветвленная структура застревает в порах геля, в результате чего ее подвижность снижается. Снижение электрофоретической подвижности молекулы коррелирует с соотношением длин денатурированного и двухцепочечного участков чем длиннее самый легкоплавкий домен, тем сильнее снижается подвижность. Участок геля, в котором молекула ДНК начинает терять скорость, соответствует самым легкоплавким доменам. Если концентрации денатурирующих веществ подобраны правильно, то два фрагмента ДНК, различающиеся лишь одной нуклеотидной заменой и имеющие неодинаковые значения Гт, начнут снижать скорость в различных участках геля, и к концу прохождения через него их легко будет разделить. Ранее считалось, что отделить мутировавшие фрагменты от фрагмента ДНК дикого типа за счет разной степени снижения их подвижности в ДГГЭ можно лишь в том случае, если замены произошли в области с самым низким значением Гт. Однако анализ большого числа образцов ДНК, а также последующие теоретические выкладки показали, что в большинстве случаев метод ДГГЭ дает возможность обнаружить нуклеотидные замены во всех областях плавления, за исключением самых термостабильных [18, 19]. Замены в областях с самой высокой температурой плавления обычно не обнаруживаются, так как по окончании плавления последнего домена ДНК полностью денатурирует, а это приводит к нарушению корреляции между конформацией молекулы и скоростью ее продвижения. Важно помнить, что успех при проведении ДГГЭ с целью разделения мутировавшего фрагмента и фрагмента ДНК дикого типа определяется структурой фрагмента. Она должна быть разветвленной, причем мутации должны приходиться на области, подвергшиеся плавлению. Для увеличения разрешающей способности метода к исследуемому фрагменту ДНК пришивали последовательность с более высокой температурой плавления ДНК, так называемый ОС-зажим . При этом все области плавления фрагмента, включая самую тугоплавкую, становились доступными для анализа [18, 19]. Эти опыты проводили с препаратами ДНК, клонированными в плаз-мидном векторе, содержащем ОС-зажим . Чтобы избежать стадии клонирования, фрагменты с зажимами можно получить в полимеразной цепной реакции (см. разд. 2.3). [c.131]

Для определения оптимального времени электрофореза можно поставить простой эксперимент с оптимизирующим гелем. Аликвоты клонированного фрагмента тестируемой ДНК, вы-щепленного рестриктазами из вектора, наносят на параллельноградиентный гель с интервалом в 1 ч. Проводят электрофорез и затем окрашивают гель бромидом этидия, как было описано выше. Фотографируя гель с линейкой-маркером, расположенной сбоку, мол<но установить, в результате какого из нанесений (по времени) фрагмент ДНК оказался в зоне геля с концентрацией денатурирующего вещества, соответствующей Гт его первого домена плавления (рис. 9,Л). [c.164]

Рассказывая о клонировании фрагмента ДНК, мы подразумевали, что нам доступен искомый ген или известна молекулярная масса фрагмента, который можно извлечь из электрофореграммы рестриктов ДНК. В действительности для получения нужного гена чаще всего необходимы поиски, и порой достаточно сложные. Для этого геномную ДНК, разрезанную выбранной рестриктазой, смешивают с ДНК вектора, вскрытого той же рестриктазой по уникальному сайту. В результате взаимодействия липких концов и последующего лигирования получают смесь рекомбинантных ДНК. После этого полученные плазмиды со вставками различных участков ДНК необходимо расклонировать. [c.275]

Смотреть страницы где упоминается термин Векторы для клонирования ПЦР-фрагментов ДНК: [c.62] [c.74] [c.113] [c.337] [c.373] [c.195] [c.200] [c.39] [c.281] [c.43] [c.139] [c.174] [c.183] [c.183] [c.40] [c.40] [c.41] [c.40] [c.40] [c.41] [c.116] [c.116]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология