Носитель твердофазный для антител

Для проведения такого анализа необходимо эффективное отделение комплексов от свободных компонентов. Эта задача достаточно легко решаема, если антиген, либо антитело иммобилизовать на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и разделить иммунные комплексы и свободные компоненты. Возможность прочного связывания на носителе антигенов или антител с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов привела к созданию твердофазных иммунохимических методов, широко используемых в настоящее время в химическом анализе. [c.114]

Особую значимость для широкого внедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полисти-рольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах РИА. Введение в практику ИФА полистирольных плат позволило значительно увеличить число-проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок платы. [c.7]

К носителю с иммобилизованным антигеном добавляют раствор определяемого антигена и раствор, содержащий фиксированное количество меченных ферментом специфических антител. После инкубации и отмывки несвязавшихся с носителем компонентов определяют ферментативную активность на носителе. Метод является твердофазным, так как носитель с иммобилизованным антигеном используют на первой стадии анализа, включает лишь одну равновесную стадию инкубации, поэтому время анализа определяется в основном продолжительностью этой стадии, однако не дает возможности избежать контакта фермента-маркера с анализируемой средой. В связи с этим ограничения его применения могут возникать при необходимости анализа биологических жидкостей (сыворотка [c.95]

Использование твердых носителей для иммобилизации антител с последующим специфическим связыванием определяемого соединения на сорбенте и идентификацией образовавшихся нммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов лежит в основе методов твердофазного иммуноферментного анализа (метод гетерогенного ИФА). [c.115]

Метод также является твердофазным и формально имеет сходные черты с вышеописанным ингибиторным анализом. Отличие заключается в том, что на первой стадии используют немеченые специфические антитела, а для выявления образующихся на носителе специфических иммунохимических комплексов вводят в него ферментативную метку с помощью реакции с меченными ферментом вторичными антителами. [c.96]

Гетерогенные методы ИФА включают стадию разделения свободного меченого компонента от образовавшегося комплекса со связываюш,им агентом. Задача разделения эффективно решается при использовании антител (или антигенов), иммобилизованных на нерастворимых носителях. Методы, основанные на данном подходе, известны под названием твердофазных методов ИФА. [c.201]

В связи с интенсивным применением иммобилизованных ферментов в биотехнологии методы получения различных нерастворимых производных соединений белковой и небелковой природы хорошо разработаны. Многие из них могут быть эффективными и для получения-иммобилизованных препаратов антител и антигенов (иммуносорбентов). Чаще всего для целей твердофазного ИФА приготовление иммуносорбентов осуществляют либо ковалентным связыванием, либо адсорбцией вещества на поверхности носителя. [c.201]

Наиболее широко применяемыми носителями в твердофазном ИФА являются 96-луночные планшеты и пробирки из оптически прозрачного полистирола, поливинилхлорида или других полимерных материалов, с внутренней поверхностью которых связываются антитела. Как отмечалось ранее, в большинстве случаев иммобилизацию проводят адсорбционно, что упрощает процедуру, но снижает прочность связи белка с носителем. Увеличение прочности связывания может быть достигнуто при ковалентном закреплении антител на пластике. [c.206]

Особое распространение получили методы, основанные на использовании антигенов и антител, меченных ферментами, — так называемый иммунофермеитный анализ. Они используются для изучения широкого круга соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, различных белков и ферментов. Существуют гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы иммуноферментного анализа, принципиально различающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител или антигенов, иммобилизованных на нерастворимых носителях. [c.306]

Иммобилизация антител на водорастворимых полимерах. Новым подходом в иммунохимическом анализе является применение антител, иммобилизованных на обратимо растворимых иммуносорбентах, что позволяет проводить анализ в растворе, а затем быстро разделять компоненты путем перевода носителя в нерастворимое состояние. Данный путь дает возможность сочетать чувствительность твердофазного анализа с быстротой гомогенного. В качестве водорастворимого носителя может быть использован альгинат натрия и полиметакриловая кислота (ПМАК). [c.211]

Применение в ИФА иммуносорбентов позволяет проводить определение любых соединений, независимо от их валентности, размеров, структуры и молекулярной массы. Однако возможности твердофазных систем анализа (ни й ний предел обнаружения антигена, время, воспроизводимость) в значительной степени определяются такими величинами, как концентрация, аффинность и стабильность иммобилизованных антител. В связи с этим ниже дана краткая информация об этих параметрах и путях их определения на примере наиболее распространенных пористых и непористых носителей. [c.217]

Стабильность иммобилизованных антител при хранении. Постоянство концентрации и сродства иммобилизованных антител является необходимым условием для получения воспроизводимых результатов твердофазного ИФА. Изменение этих характеристик может происходить за счет десорбции или разрыва химической связи антител с носителем и денатурации связанного белка. Экспериментально изменение концентрации или свойств иммобилизованных антител проявляется в уменьшении степени связывания в стандартных условиях фиксированной концентрации меченого антигена. [c.221]

Описанный в разд. IV твердофазный РИА является очень чувствительной и удобной методикой определения липидных антигенов. Как уже было отмечено, некоторые антитела в условиях, при которых проводят эксперимент, имеют тенденцию к неспецифическому связыванию с твердофазным носителем, поэтому при первичных тестах следует использовать в качестве контроля носитель, не покрытый липидом. Это удваивает объем работы при скрининге супернатантов гибридом на связывание с липидными антигенами. [c.171]

Одним из важных моментов в проведении иммуноферментного анализа является разделение свободных и связанных с антителами меченых компонентов. В настоящее время разработано несколько вариантов решения данной проблемы. Наиболее распространен метод, основанный на иммобилизации антител на твердой подложке (стеики полистирольных пробирок или шариков, целлюлозные диски, гранулы макропористых носителей для хроматографии). Особенно перспективными оказались полистироло-вые пробирки или планшеты, содержащие 96 лунок. Сущность методов разделения основана на том, что одни из компонентов, например антитела, могут быть сорбционно иммобилизованы на поверхности измерительной кюветы. После проведения инкубации с образцом антиген сорбируется на поверхности, а все остальные компоненты остаются в растворе и могут быть легко отделены, например, с помощью пористых частиц под действием магнитного поля. Основными проблемами, возникающими при реализации твердофазных методов разделения, являются стандартизация поверхности и уменьшение неспецифического связывания меченых компонентов с носителем. [c.114]

Наиболее простой способ снятия неспецифического фонового излучения состоит в использовании твердофазных вариантов метода. В качестве твердой фазы берут пблистирольные пробирки, микропланшеты, полиакриламидные шарики. Иммобилизация антител (моноклональных или поликлональных) на полистироле осуществляется методом нековалентной физической адсорбции, а в случае полиакриламидных частиц — ковалентным связыванием. Различие в способах иммобилизации обусловливает некоторые различия в свойствах иммобилизованных антител. Из. всех перечисленных носителей полиакриламидные шарики, как правило, обеспечивают. повышенную стабильность и иммунореактивность иммобилизованных антител, более быструю кинетику специфического взаимодействия, что улучшает точность анализа и его воспроизводимость. [c.142]

Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена —Fab-фрагментом. Обусловлено это прежде всего тем, что рс-фрагмент молекулы, ответственный за эффек-торные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов. [c.155]

Получение антигенов и антител, связанных с Носителем, является одной из суш,е-ственных процедур при разработке твердофазного ИФА, так как от степени сохранения стабильности и активности иммобилизованных препаратов зависят количественное характеристики метода и возможность его практического применения. Другой важной областью применения иммуноч сорбентов для целей ИФА является очистка антигенов и антител для последующей метки ферментом или использования в качестве стандартного образца. [c.201]

Твердофазные иммунореагенты вначале использовали для выделения антигенов и аитител. Впоследствии иммобилизованные антитела применили для радиоиммуноанализа белков [1, 2] и гаптенов [3,4 ], где с их помощью удалось упростить разделение свободного и связанного с антителами определяемого вещества. Реагенты (антитела или антигены) связывали с носителем или ковалентно, или с помощью пассивной адсорбции. Ковалентное связывание требует проведения химических реакций и тщательной очистки готового продукта. Связывание путем пассивной адсорбции занимает много времени, а полученные таким способом реагенты сложно ис- [c.52]

Ситуация резко изменилась после введения неизотопных меток для регистрации реакции антиген - антитело [5 ], и особенно после применения моноклональных антител в двухцентровом им-мунометрическом анализе белков [б ]. Необходимость создания высокочувствительных методов иммуноанализа для научных исследований, а также более простых методик для проведения анализов в поликлиниках, полевых условиях и для самодиагностики также содействовала бурному развитию твердофазных методов. Носители, применяемые в этих анализах, могут быть выполнены в виде трубок, шариков, мелких гранул, микропланшетов, полосок, пленок и электродов. [c.53]

Данные, представленные в этом разделе, в целом подтверждают представления об ускорении переноса белков через грани-ду жидкость — твердое вещество при обработке ультразвуком. Известно сходное влияние ультразвука на гетерогенный катализ в системах, содержащих иммобилизованные ферменты (Berezin et al., 1977). Маловероятно, чтобы ультразвук необратимо изменял доступность или степень сродства иммобилизованных антител, однако нельзя исключить кратковременного уменьшения пространственных затруднений вследствие периодического возмущения твердого носителя. Наиболее удовлетворительное объяснение действия ультразвука состоит в том, что он вызывает эффективное микроперемешивание за счет схлопывания кавитационных пузырьков и создания в жидкости потоков. Считают, что такое перемешивание уменьшает толщину неподвижного слоя растворителя, прилегающего к твердым поверхностям, и тем самым благоприятствует диффузии и массопереносу через границу раздела фаз (Борисов, Статников, 1966). По-видимому, этот эффект имеет всеобщий характер и может быть использован в других методах, основанных на твердофазном связывании, таких, как метод ELISA в платах для микротитрования, радио-иммунологический анализ, анализ ДНК и рецепторов. [c.149]

Романи и соавторы для проведения радиоиммунных определений различных белков хроматина, в частности HMG-1, в качестве твердофазного носителя использовали гибкие платы для микротитрования на 96 лунок, изготовленные из полихлорвинила. В лунки вносили по 0,1 мл белкового раствора в обычном фосфатно-солевом буфере, выдерживали 4 ч при комнатной температуре, а затем ночь на холоду (концентрации белка указаны ниже). Не сорбировавшиеся на пластик белки смывали шестью порциями по 0,3 мл того же раствора. Для блокирования центров сорбции на пластике, оставшихся незанятыми, лунки заполняли 1%-ным раствором БСА в фосфатно-солевом буфере, инкубировали и отмывали, как описано выше. Затем в лунки вносили по 0,1 мл иммунной антисыворотки кролика, разбавленной в отношении 1 200 тем же раствором БСА, инкубировали 4 ч при комнатной температуре с покачиванием и промывали 8 раз буфером. Наконец, для обнаружения связавшихся антител добавляли по 0,1 мл раствора [ 1]-белка А (10—50 тыс. имп./мин), инкубировали еще 4 ч, трижды тщательно промывали раствором БСА, 8 раз — буфером и 10 раз — водой. После этого лунки вырезали из платы и поочередно просчитывали в у-счетчике. [c.290]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология