Глюкозы определение гексокиназой

В качестве сопрягающих ферментов часто используют дегидроге-назы и их коферменты в окисленной или восстановленной форме. Например, активность гексокиназы определяют в системе, содержащей дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и НАДФ. Скорость восстановления НАДФ соответствует скорости гексокиназной реакции. Иногда используют системы двойного или тройного сопряжения, однако конечным звеном такой системы является соответствующая дегидрогеназа (например, при определении активности фосфофруктокиназы, креатин-киназы). При определении активности в сопряженной системе следует учитывать ряд условий. [c.208]

Рис. 7.7. Определение активности гексокиназы в системе, в которой протекает сопряженная фер.ментативная реакция, катализируемая глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюкоза, АТР, Mg и NADP добавлены в избытке. В этих условиях скорость общей сопряженной реакции зависит от количества добавленной гексокиназы. Эту скорость определяют по образованию NADPH, который поглощает свет при 340 нм.

Пробы 3, 6, 9 служат контролем и их не инкубируют в аппарате Варбурга. Доводят температуру в термостате до 26° С. Готовят раствор гексокиназы на 0,5 М глюкозе, исходя из расчета 0,5—1 мг гексокиназы на пробу (необходимое количество гексокиназы находят в предварительных опытах). Выделяют митохондрии из исследуемой ткани (с. 403). Во все сосудики разливают по 0,2 мл раствора гексокиназы в глюкозе и по 0,4 мл суспензии митохондрий, быстро притирают сосудики к манометрам и помещают их в термостат аппарата Варбурга. Включают качающий механизм и через 10 мин, в течение которых происходит выравнивание температуры, подводят жидкость в обоих коленах манометра до одного уровня (150—250), закрывают краны и приступают к определению поглощения кислорода. [c.468]

Препараты фермента были получены путем гомогенизирования свежих или лиофильно высушенных тканей с вероналовым или трис-буфером и последующего центрифугирования при 3000 g. Особенностью этих препаратов являлось высокое содержание в них сахаров и неорганического фосфата, что характерно как для проводящих, так и для паренхимных тканей. Поэтому определение активности гексокиназы по убыли глюкозы в опытной смеси или по убыли суммы легкогидролизуемого фосфата АТФ неорганического фосфата оказалось невозможным. Мы определяли действие гексокиназы непосредственно по количеству образующегося в течение опыта глюкозо-6-фосфата (и фруктозо-6-фосфата). Гексозомонофосфаты были выделены из опытной смеси путем фракционирования по Умб-рейту. Их количественное определение производили с помощью хроматографии на бумаге. Пятна глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата были элюированы с бумаги, и фосфорные эфиры определены по их сахарному компоненту с антроном [18]. [c.249]

Сложные взаимоотношения между различными железами внутренней секреции, регулирующими углеводный обмен, еще не выяснены. Так, известно, что для нормального баланса расщепления и синтеза углеводов необходимы секреты щитовидной железы (тироксин), поджелудочной железы (инсулин) и коры надпочечников. Недавно Кори и Кори показали, что экстракты коры надпочечников, а также определенные фракции гипофиза, способны оказывать тормозящее действие на активность гексокиназы, энзима мышц, контролирующего обратимое фос-форилирование глюкозы — важный этап в процессе использования глюкозы животным организмом. Это торможение снимается инсулином, хотя сам по себе, в отсутствие тормозящих факторов гипофиза или надпочечников, инсулин не оказывает влияния на активность гексокиназы. Эффект действия передней доли гипофиза не зависит от адренокортикотропного гормона, так как он неактивен. Гормоны коры надпочечников с атомом кислорода при Сц, обладающие гликогенной активностью, не оказывают тормозящего действия аморфная фракция активна. Однако действие экстракта коры надпочечников ке простое оно проявляется на экстрактах из мышц животных, больных диабетом, но отсутствует в опытах с экстрактами мышц нормальных животных, если к ним не добавлена активная фракция экстракта передней доли гипофиза. [c.448]

Одну из общих проблем энзимологии составляет выяснение вопроса, почему специфичность ферментативных реакций часто проявляется в максимальных скоростях, т. е. при высоких концентрациях субстрата, при которых фермент насыщен субстратом. Можно было бы ожидать, что специфичность должна проявляться в связывании субстратов, так что плохой субстрат должен слабо связываться с активным центром, но, связавшись, должен реагировать нормально. Модель замка и ключа способна объяснить, почему с активным центром фермента связываются субстраты лишь определенной структуры, однако она не может объяснить специфичность в отношении констант скоростей каталитической стадии, что является характерным свойством ферментов. Наиболее непонятное положение существует для субстратов небольших размеров, которые в состоянии связываться, хотя и непрочно, с активным центром и должны бы были претерпевать превращение. Так, фермент гексокиназа катализирует перенос фосфатной группы от АТФ на воду так же, как на гидроксильную группу специфического акцептора — глюкозы, но скорость реакции с водой составляет всего лишь З-Ю доли скорости реакции с глюкозой [7]. Совершенно очевидно, что вода в состоянии проникнуть в активный центр фермента, так что малая скорость реакции несомненно связана с низкой реакционной способностью воды в области активного центра. Многие другие ферменты, катализирующие перенос групп, эффективно катализируют перенос на специфические гидроксильные акцепторы, но катализируют слабо или не катализируют вообще перенос на воду. [c.228]

Способность раковых клеток функционировать в условиях исключительно низкой концентрации глюкозы указывает на их высокое сродство к ней. И действительно, удалось обнаружить в некоторых опухолях преобладание таких форм фермента гексокиназы (ключевого фермента цепи переработки глюкозы), у которых константа Михаэлиса значительно меньше, чем у обычных форм [6]. Второе отличие раковых клеток — способность более быстрого переноса молекул глюкозы через клеточную мембрану. Все это создает раковым клеткам определенные преимущества в конкурентной борьбе с другими клетками организма за глюкозу. Возникает подозрение, что ее нехватка является одной из причин иммунодепрессии в организме с развивающейся злокачественной опухолью. [c.124]

Представляет интерес применение электрода на основе глюкозооксидазы и ферроцена цля определения других веществ с помощью ферментов, которые конкурируют глюкозооксидазой. Например, в присутствии АТР и гексокиназы глюкоза превра- [c.215]

Определив потребление митохондриями неорганического фосфата и кислорода в аппарате Варбурга (с. 10), рассчитывают коэффициент фосфорилирования. Так как для достоверного определения кислорода и неорганического фосфата необходима довольно продолжительная инкубация митохондрий, в реакционную смесь обычно вносят АДФ-реге-нерирующую систему (чаще всего для этой дели используют гексокиназу с глюкозой). Это удобно также потому, что гексокиназа успешно конкурирует с митохондриальными АТФ-азными реакциями, которые могут сильно искажать результаты опытов, гидролизуя образующийся в ходе фосфорилирования АТФ. [c.467]

Схема 7.в-10. Пути реакций согласно связанному с редокс-ферментом ампе-рометртчесиому измерению с помощыо редокс-к№диатора. 6 — определение глюкозы (л)- -(б)—определение креатина, креатинкиназы или гексокиназы, [c.539]

Для определения глюкозы могут быть использованы различные ферменты система глюкозооксидаза - пероксидаза [3, 60], гексокиназа - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа [3], глюкозодегид-рогеназа [3]. Однако наибольшее распространение получила первая система. Схема определения в данном случае выглядит так [c.133]

Хотя две описанные выше группы ферментов катализируют реакции переноса, их не называют трансферазами , так как по определению трансферазы это ферменты, которые осуществляют перенос части молекулы донора, за исключением водорода и электронов, на молекулу акцептора, причем ни донором, ни акцептором не является вода . Трансферазы — очень большая группа ферментов. В нее входят фосфотрансферазы, обычно называемые киназами , которые катализируют перенос остатка фосфата от одного соединения на другое. Например, гексокиназа катализирует перенос концевого фосфатного остатка аденозинтрифосфата на глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата. Трансаминазы осуществляют перенос аминогруппы от а-аминокислоты на а-кетокислоту. Обзор, посвященный трансферазам, опубликован Гоффманн-Остенгофом [17] в 1960 г. [c.12]

Эти условия фактически разобщают действие двух ферментов во времени, исключая тем самым их конкуренцию за один и тот же пул метаболитов. А в случае взаимопревращения глюкозы и глюкозо-6-фосфата два фермента разобщены также в пространстве. Глюкозо-6-фосфатаза, представляющая собой ли-попротеид, связана с микросомами, тогда как гексокиназа, вероятно, либо непрочно присоединена к митохондриям, либо находится в растворе в свободном виде. Это пространственное разобщение, несомненно, играет определенную роль в предотвращении замыкания на этом участке метаболизма. [c.56]

Гексокиназа, особенно дрожжевая, была объектом широких кинетических исследований. При этом были получены как свидетельства того, что имеет место упорядоченный механизм [91] с определенной последовательностью ювязьквания глюкозы и MgATФ , так и противоположные аргументы в пользу независимого присоединения субстратов к свободному ферменту по типу быстрого статистического ра)Вновесия [92]. Подобное противоречие еще раз подчеркивает, что на основании чисто кинетических экспериментов очень трудно получить однозначный ответ о механизме действия фермента. [c.682]

Группа французских иоследователей впоследствии представила результаты физико-химического изучения гексокиназы, которые в некоторой степени подтверждают их гипотезу об упорядоченном механизме. Им удалось показать, что фермент из дрожжей связывает глюкозу прочнее, чем МдЛТФ - [93]. Подробное исследование ингибирования фермента позволило Косоу и Роузу [94] заключить, что при некоторых условиях (малые или умеренные ингибирующие концентрации МдЛДФ ) продукты реакции выделяются в определенной последовательности — сначала глюкозо-6-фосфат, а затем АДФ. [c.682]

Ферментативная методика. Многие исследователи показали, что гек-сокиназа из мозга или из дрожжей в присутствии АТФ катализирует превращение глюкозамина в его 6-фосфат [236—238]. Слейн [222] использовал этот метод для раздельного определения о-глюкозамина и о-галактозамина, поскольку фермент специфичен для производного глюкозы. После реакции Эльсона — Моргана смесь обрабатывают частично очищенной дрожжевой гексокиназой. Глюкозамин-6-фосфат осаждают сернокислым цинком и гидроокисью бария и вновь определяют оставшийся аминосахар. Однако Джонстон [239] показал, что глюкозамин-6-фосфат не осан дается количественно в этих условиях он модифицировал метод, применив отделение галактозамина перед определением на дауэксе-50. [c.217]

Для определения глюкозы применяют либо тексокиназу, либо глюкозооксидазу с каталазой. Растворимую тексокиназу использовали в энтальпиметрическом методе с прямым вводом проб для определения глюкозы в диапазоне 0,5-50 ммоль/л [29]. Применение аналогичной системы с иммобилизованной гексокиназой давало возможность определять концентрации глюкозы в диапазоне 0,5-25 ммоль/л [2]. Учитывая высокую производительность (40 проб/час), точность, а также долговременную стабильность и воспроизводимость, рассматриваемую систему можно считать в высокой степени приемлемой в качестве рутинного инструмента для клинического определения глюкозы. [c.464]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология