Клонирование генов. Векторы

Клонирование генов. Векторы [c.272]

Рис. 4.1. Клонирование рекомбинантной ДНК. Донор-ную ДНК расщепляют рестрицирующей эндонуклеазой и встраивают в клонирующий вектор. Полученную конструкцию вводят в попу ляцию клеток-хозяев, идентифицируют те клетки, которые содержат рекомбинантную ДНК, и культивируют их. При необходимости можно индуцировать экспрессию клонированного гена в клет-ках-хозяевах и получить кодируемый им белок.

Как следствие метаболической перегрузки, обусловленной образованием избыточного количества чужеродного белка и нехваткой питательных веществ или строительных блоков — аминокислот, может произойти запуск стрессовых механизмов, в частности инициироваться синтез клеточных протеиназ, под действием которых произойдет быстрая деградация рекомбинантного белка. Истощение пула аминокислот может стать результатом эффективной экспрессии не только клонированных генов-мишеней, но и генов самого вектора, кодирующих маркеры устойчивости к антибиотикам. [c.128]

В экспрессирующие векторы млекопитающих уже встроены гены самых разных белков и осуществлена их экспрессия в хозяйских клетках. Иногда выход продукта увеличивался, если между промотором и клонированным геном встраивали интрон. Механизм этого феномена неизвестен. Возможно, первичный транскрипт клонированного гена содержит скрытые сайты сплайсинга, по которым вырезается часть кодирующей области клонированного гена, а при наличии дополнительного интрона сплайсинг по ним происходит с меньщей вероятностью. [c.150]

Прокариотические системы экспрессии успещно используются для синтеза многих белков. Однако некоторые белки для превращения в активную форму должны претерпеть специфические пост-трансляционные модификации - гликозилирование, фосфорилирование или ацетилирование, а бактерии к этому не способны. Поэтому бьшо решено попытаться экспрессировать клонированные гены в эукариотических клетках с помощью специально созданных эукариотических экспрессирующих векторов. [c.154]

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных [c.439]

Рис. 8.7. Внесение случайных мутаций в клонированный ген. Вектор, несущий клонированный ген, расщепляют рестриктазами RE1 и RE2, в результате чего образуются один 3 - и один 5 -укороченные концы (и соответственно один 3 - и один 5 -выступающие концы). Затем его обрабатывают ферментом ЕхоТП, который расщепляет ДНК только с укороченного 3 -конца, удаляя по одному нуклеотиду. Через некоторое время реакцию останавливают и заполняют образовавщийся пробел с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. соИ. При этом в реакционную смесь добавляют все четыре дезоксинуклео-зидтрифосфата (dNTP) и в небольшом количестве -аналог одного из них. Обрабатывают продукт нуклеазой S1 для образования тупых концов, лигируют с помощью ДНК-лигазы Т4 и трансформируют клетки

Из организма - донора нужных генов - экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мищень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция клонирующий вектор-встроенная ДНК ). [c.50]

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Рис. 6.5. Клонирующий вектор pAVlO (без соблюдения масштаба). Показано положение гена устойчивости к тетрациклину (Tef), сайта рестрикции для эндонуклеазы Bglll, сайта инициации репликации (ori), промотора (р) и полилинкера (ПЛ). Встраивание клонированного гена в полилинкер ставит его под контроль промотора Тп5 (р). Стрелка указывает направление транскрипции.

Рис. 6.11. Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А. Клонированные гены вырезают из клонирующего вектора с помощью рестрицирующей эндонуклеазы Abel и отделяют от векторной ДНК. . Создают условия, при которых происходит сшивание вырезанных генов. Поскольку нуклеотидные последовательности обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации. В результате образуются тандемные повторы из случайно ориентированных последовательностей.

Клонируемый ген встраивают в N ol-, Pst -или // иёШ-сайт, расположенный между сайтом связывания рибосомы и сайтами терминации транскрипции. Если его рамка считывания не попадает в ногу с кодоном AUG, то необходимо произвести минимальную коррекцию. В этом случае после индукции и транскрипции происходит достаточно эффективная трансляция клонированного гена. Однако следует иметь в виду, что поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевой участок белка-мищени, у разных клонированных генов неодинакова, нельзя создать универсальный вектор, исключающий одноцепочечное спаривание мРНК при любых обстоятельствах. Поэтому ни одна из областей инициации трансляции, как бы она ни была оптимизирована, не может га- [c.121]

На первый взгляд разработка любой эукариотической системы экспрессии представляется относительно простой процедурой, состоящей в подборе соответствующих регуляторных последовательностей, встраивании их в вектор в определенном порядке и клонировании гена-мишени таким образом, чтобы обеспечивалась его эффективная экспрессия. На практике же создание первого поколения эукариотических экспрессирующих векторов оказалось весьма кропотливым делом, основанным на методе проб и ошибок. До появления работы Муллигана, Хоуарда и Берга [c.146]

Для вьщеления специфических гетерологичных белков из клеточных экстрактов и из смесей секретируемых белков можно использовать разные подходы. Один из них основывается на присоединении к клонированному гену - без нарущения рамки считывания - сегмента ДНК, кодирующего короткую аминокислотную последовательность, которая специфически связывается с каким-либо химическим элементом, соединением или макромолекулой. Такую конструкцию встраивают в экспрессирующий вектор между промотором и сайтом терминации транскрипции. Короткая аминокислотная последовательность в составе рекомбинантного белка, синтезируемого в хозяйской клетке, играет роль аффинной метки. В одном случае перед клонированным геном был встроен - без нарущения рамки считывания - сегмент ДНК, кодирующий щесть остатков гистидина (Hisg), спейсерный участок, кодирующий семь аминокислот, и сайт [c.149]

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Рис. 7.16. Экспрессирующий вектор с двумя независимо транскрибируемыми генами. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (ар). Каждый ген встроен в вектор как часть отдельной единицы транскрипции и находится под контролем эукариотического промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Каждая субъединица транслируется со своей мРНК объединяясь, субъединицы образуют функциональный димерный белок (ар). Векторы содержат сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ (оп ) и в клетках млекопитающих (р /сик) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Рис. 7.17. Двухцистронный экспрессирующий вектор. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (а 3). Они разделены сегментом ДНК, который после транскрипции, на уровне мРНК, играет роль внутреннего сайта связывания рибосом. Каждый ген находится под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Трансляция мРНК начинается с 5 -конца и с внутреннего сайта (угловые стрелки). Синтезированные субъединицы объединяются с образованием функционального димерного белка. Вектор содержит сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ orf) и в клетках млекопитающих (orF y, селективный маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. соИ селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, использовались дрожжи S. erevisiae. Их генетика хорошо изучена, а кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах. Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью S. erevisiae было получено множество самых разных аутентичных белков. Однако многие рекомбинантные белки в этой системе не подвергались носттрансляционной модификации, к тому же их выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбинантных белков. [c.154]

Частоту появления рекомбинантных бакуловирусов удалось повысить с менее чем 1% до 99%. Для этого ДНК A MNPV обрабатывали эндонуклеазой рестрикции, которая расщепляла ДНК в двух специфичных сайтах с высвобождением фрагмента, несущего часть гена, необходимого для осуществления литического цикла. Клетки насекомого трансфицировали этим фрагментом, а затем — транспортным вектором. В результате двойного кроссинговера в некоторых клетках восстанавливался кольцевой геном A MNPV, который содержал клонированный ген и функциональный ген, необходимый для осуществления литического цикла. В результате почти все вирулентные бакуловирусы оказывались рекомбинантными. [c.155]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Е. соИ. При ренатурации одиночных цепей из одной пробирки образуются линейные молекулы. В клетках Е. oli стабильно поддерживаются в виде плазмид и наследуются только кольцевые, а не линейные молекулы, при этом все они несут сайт-специфическую мутацию. Таким образом, с помощью описанного метода можно вносить точ-ковые мутации в клонированный ген, при этом отпадает необходимость во встраивании гена в ДНК фага М13, использовании мутантных штаммов Е. соН типа dut ung и в переносе мутантного гена из Ml 3-вектора в экспрессирующий вектор. [c.163]

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного мутагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага M13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК M13 клетки Е. соИ. Часть образующихся в клетках фаговьгх частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую [c.175]

С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу. [c.224]

В табл. 12.2 представлены результаты определения количества триптофана, синтезированного мутантным щтаммом С. glutami um и штаммом дикого типа, которые содержали или не содержали вектор с клонированным геном антранилатсинтазы. Как видно из таблицы, клони- [c.256]

Самый простой способ использования природной способности Ti-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя нуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Ti-плазмид и А. tumefa iens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Ti-плазми-ды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования. [c.377]

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5 "-концевой участок гена gag и 5 - и 3"-LTR, а затем рядом с / -областью встраивают терапевтический ген, транскрипция которого будет контролироваться 5"-LTR-промотором при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором (рис. 21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена, На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, - примерно 8 т. п. н. [c.488]

Клонированные гены, рекомбинантные белки, моноклональные антитела, плазмиды, промоторы, векторы, кДНК, моновалентные вакцины [c.535]

Клонирование генов (Gene loning) Система методов, использующаяся для получения клонированных ДНК вьщеление нужного гена из какого-либо организма, встраивание его в плазмиду (вектор), введение в клетку организма-хозяина, многократная репликация. [c.550]

Экспрессирующий вектор (Expression ve tor) Плазмидный вектор, сконструированный таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе клеточного цикла и только в течение определенного времени. Для этого в плазмиду встраивают сильный регулируемый промотор. [c.564]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование генов. Векторы: [c.21] [c.62] [c.107] [c.120] [c.121] [c.137] [c.143] [c.144] [c.146] [c.147] [c.148] [c.149] [c.153] [c.154] [c.159] [c.244] [c.379] [c.387] [c.511] [c.550]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология