Выделение индивидуальных белков

Область применения препаративное выделение индивидуальных белков из белковых смесей, очистка белковых фракций. [c.83]

Но прежде всего эта новая технология произвела переворот в самих молекулярно-биологических исследованиях. Дело в том, что каждый конкретный белок производится клеткой, как правило, в очень малом числе, нередко всего по одной-две молекуле на клетку. В результате выделение индивидуального белка, нужного для экспериментов, превращается в труднейшую и весьма дорогую процедуру. Чтобы получить миллиграммы белка, приходится перерабатывать десятки килограммов, если не тонны, биомассы. Но все равно очистить как следует белок, когда он присутствует в столь малой концентрации, не удается. Отсюда — чрезвычайная дороговизна многих белковых препаратов и их недостаточная чистота. [c.64]

Способность к ионному обмену используют для концентрирования, очистки и разделения смесей разнообразных органических веществ. При этом оказывается возможным селективно и четко разделить (не говоря уже о концентрировании и очистке) компоненты смеси благодаря тому, что реакционная способность, т. е. способность к обмену, является функцией строения последних. Особо следует отметить развивающееся в последние годы направление по разделению сложных белковых смесей и выделению индивидуальных белков, основанное на применении специально приготовленных ионитов (в виде тонких слоев), обеспечивающих высокую селективность. [c.289]

Несмотря на это, белковые вещества чрезвычайно многочисленны и разнообразны следовательно, причиной этого различия главным образом служит не разное процентное содержание образующих их элементов, а различие в строении и размерах их молекул, которые очень велики. Установление точной формулы белковых веществ представляет большие трудности, так как, с одной стороны, природные (нативные) белки являются смесями нескольких белков и выделение индивидуальных белков весьма трудная задача, с другой, к белкам, являющимся типичными коллоидами, неприменимы обычные методы определения молекулярного веса. [c.323]

На различиях каких физико-химических свойств белков основаны методы разделения и выделения индивидуальных белков [c.52]

Выделение индивидуальных белков из смесей. Как правило, первичной процедурой вьщеления белка является его осаждение с помощью высаливания с использованием солей аммония и щелочных металлов высоких концентраций. Далее применяют целый ряд методов концентрирования и тонкой очистки белков, из которых наиболее эффективными являются хроматографические методы. На стадии концентрирования белка приме- [c.77]

Методы иммунохимии за последние годы заняли важное место в исследованиях белков и нуклеиновых кислот. Это обусловлено уникальной возможностью обнаружения и выделения индивидуальных белков и нуклеопротеидов из сколь угодно сложной их смеси с помощью специфических антител , вырабатываемых в организме соответствующим образом иммунизированного животного. Однако эти методы, наряду со своей ни с чем не сравнимой избирательностью, таят в себе и возможности серьезных ошибок. Дело в том, что при реальной постановке эксперимента всегда есть место для сомнения в том, действительно ли используемая популяция антител специфична, тем более что антителам, как будет видно из дальнейшего, иногда присуща определенная поливалентность , т. е-. способность взаимодействовать с различными антигенами , в частности с различными белками. [c.82]

ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЛКОВ [c.54]

Главная трудность выделения индивидуального белка состоит именно в его отделении от остальных белков. Все белки как соединения одного класса обладают сходными свойствами, и их фракционирование основано на небольших различиях в свойствах разных белков. В процессе выделения по возможности избегают денатурирующих воздействий работу проводят при температуре, близкой к О °С, не применяют сильнокислых или сильнощелочных растворов. [c.54]

Выделение индивидуального белка требует последовательного применения многих приемов (см. рис. 1.37 и табл. 1.9). Ход выделения контролируют по увеличению содержания вьщеляемого белка в препарате после каждой стадии. Концентрацию выделяемого белка в препаратах сравнивают по способности этих препаратов связывать специфический лиганд (функциональная активность), как это описано выше. Активность выражают в условных единицах, например в единицах поглош ения света (оптической плотности), и рассчитывают на 1 мл препарата. Активность ферментов измеряют по скорости катализируемой ими реакции (см. гл. 2). [c.58]

Прн выделении желаемого белка обычно сначала экстракцией водой илн разбавленным солевым раствором получают обогащенную белковую фракцию. Собственно, процесс разделения может основываться на различной (в определенных условиях) растворимости, различном размере, различном электрическом заряде илн различных адсорбционных свойствах молекул белков, а также на различной биологической активности. К выделению индивидуального белка может привести также взаимодействие с комплексо-образующимн веществами, например альбуминами, альгинатами, пектинами [26]. [c.346]

В течение первой половины иашего столетия были открыты все аминокислоты, входящие в состав растительных белков, изучены возможные пути их превращений, определено содержание белков и небелковых соединений азота в различных растениях, а также влияние условий выращивания растений на количество белков в них. Были выделены и изучены многие ферменты, катализирующие обмен азотистых соединений, и выявлены некоторые факторы, оказывающие влияние на синтез белков. Однако до начала пятидесятых годов оставались невыясненными многие важнейшие процессы белкового обмена. К этому времени имелись скуднтме данные по аминокислотно1му составу растительных белков, не было надежных методов выделения индивидуальных белков, были получены лишь очень приближенные, зачастую противоречивые данные о скоростях синтеза, распада и обновления белков в растениях и оставалась невыясненной важнейшая проблема биохимии и биологии в целом— механизм синтеза белков. [c.286]

Выделение индивидуальных белков сопряжено с большими трудностями. Во многих случаях они выде яяются в виде смесей, которые трудно разделить. Большинство методов, применяемых в органической химии для очистки и идентификации вещества (например, перегонка, перекристаллизация, определение температуры плавления, определение молекулярного веса методами эбулиоскопии и криоскопии и т. д.), к белкам неприложимо. В последнее время появился ряд новых методов, с помощью которых удается получать препараты индивидуальных белков. [c.698]

Белки представляют собой сложные органические соедине1 ия, поэтому выделение индивидуального белка и изучение его состава и строения представляет большие трудности. Установлено, /что почти все белки состоят из пяти основных элементов в следующем процентном соотношении углерода — 50—55%, водород а — 6,6—7,3%, кислорода — 21,5—23,5%, азота — 15—18%, серы — [c.210]

Методы вьщеления индивидуальных белков. При выделении индивидуальных белков обычно сталкиваются со следующими трудностями 1) низкое содержание белка в исходном материале (часто < 0,1 % от сухой массы) 2) лабильность белков, что не позволяет применять традиционные методы органической химии (нафевание, перегонка, кристаллизация) 3) связь белков со структурными элементами клеток или наличие их в белково-липидных, белково-угле-водЦых и других комплексах биологических жидкостей 4) наличие близких физико-химических свойств у разделенных белков. [c.49]

Выделение индиввдуального белка. Для выделения индивидуального белка из смеси белков с близкими физико-химическими свойствами используют различия по молекулярной массе (методы ультрацентрифугирования и гель-хроматографии) различия в заряде (методы электрофореза и ионообменной хроматографии) способность белков к специфическим взаимодействиям (аффинная хроматография). [c.50]

Для изучения биологических особенностей белковых веш,еств и их химической структуры важно получить индивидуальные белки, свободные от примесей. Однако это связано с определенный] трудностями. Дело в том, что в большинстве случаев белки неоднородны, они легко связываются как друг с другом, так и с иными веществами, образуя с ними часто довольно прочные комплексные соединения. Расчленить эти комплексы нелегко. Поэтому получение белков в кристаллическом виде не всегда еще гарантЕфует выделение индивидуальных белков, так как некоторые белки, близкие по своим свойствам, кристаллизуются вг лес-те с образованием кристаллов одинаковой формы. [c.9]

Получение белков в кристаллическом виде не всегда еще 1 арантирует выделение индивидуальных белков, так как иногда несколько близких друг к другу по своим свойствам белковых веществ кристаллизуются вместе с образованием кристаллов общей для них формы. В этих случаях кристаллические белки представляют собою смеси или комплексы, состоящие из нескольких индивидуальных белков. Так, например, установлено, чтс> кристаллический миоген, выделенный из мышц, включает несколько индивидуальных белков. Неоднородными по своему химическому составу ока зались кристаллический р-глобулин молока и некоторые иные препараты кристаллических белков. Неоднородность состава препаратов кристаллических белков устанавливается физико-химическими методами (например, методом электрофореза, ультрацентрифугированием), а также изучением их биологических особенностей. Так, например, установлено, что кристаллический миоген обладает активностью нескольких ферментов. Учитывая специфичность действия ферментов, следует считать, что кристаллы мио-гена представлены не одним всего, а несколькими индивидуальными белками. [c.35]

Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессируюш,его вектора кодируюш,ую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладаюш,его избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка. [c.124]

Еще большая дробность фракционирования белковых смесей вплоть до выделения индивидуальных белков обеспечивается при проведении электрофореза в поддерживающих средах с градиентом pH. Поскольку в этом случае положение белка на том или ином уровне в колонке или тонком слое носителя определяется значением его изоэлектрической точки, метод получил название изоэлектрического фокусирования (синонимы—электрофокусирование, изота-хофорез). Градиент pH создается при посредстве специально синтезированных для этой цели О. Вестербергом полиаминополикарбоновых кислот—амфоли-нов, состав которых выражается следующей формулой [c.29]

Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и живот ных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помош ью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение веш ества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию ( молекулярное просеивание ), новые методы электрофореза и др. [c.17]