Афинная хроматография лиганда

Рис. 1.19. Механизм разделения веществ в афинной хроматографии а) иммобилизация лиганда на матрице Ь) нековалентное связыва ие целевого вещества и удаление сопутствующих примесей с) десорбция целевого компонента

Коферменты как специфические лиганды в афинной хроматографии 642 Литература 644 [c.9]

КОФЕРМЕНТЫ КАК СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЛИГАНДЫ В АФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ [c.642]

Метод афинной хроматографии основан на единственной в своем роде биологической специфичности взаимодействия между биологическими макромолекулами, такими как ферменты, и лигандами — субстратами, специфическими ингибиторами и коферментами. Этот мощный метод приобретает все возрастающее значение для очистки ферментов. Обычным экспериментальным приемом в связи с этим является образование ковалентной связи между специфическим лигандом и нерастворимой матрицей-носителем. Результирующий материал пакуют в колонку, на которой, в принципе, будет сорбироваться только фермент (ферменты), обладающий значительным сродством к лиганду, в то время как все другие белки будут беспрепятственно проходить через нее. Элюция специфически адсорбированного белка достигается изменением состава растворителя, благоприятствующим диссоциации комплекса фермент-лиганд [127]. [c.642]

Афинная хроматография основана на специфичности биомолекул Принципиально этим методом возможно получение абсолютно чистых веществ В нативном состоянии ферменты за счет своего активного центра и регуляторного участка (одного или более) взаимодействуют с небольшим числом лигандов, которые представляют собой субстраты, либо эффекторы Благодаря высокому сродству активного участка фермента к лиганду, их обратимому связыванию и отсутствию какой-либо другой реакции между лигандом и матрицей возможно эффективное проведение афинной хроматографии [c.51]

В качестве лиганда обычно используют конкурентный обратимый ингибитор (см ), его ковалентно сшивают с соответствующей нерастворимой матрицей так, чтобы он не терял своей способности связываться с ферментом Матрицей с лигандом в соответствующем буферном растворе заполняют колонку, а затем через нее пропускают раствор фермента, подлежащий очистке В колонке задерживается лишь специфический фермент, а все другие примеси уходят После этого проводят элюцию специфического фермента, используя раствор субстрата в среде с другим pH и (или) ионной силой При разделении ферментов методом афинной хроматографии необходимо знать все кинетические параметры целевого фермента, располагать хорошей матрицей и удачно подобранным лигандом В качестве примера приводим схему путей сшивания лиганда с одной из возможных гидроксильных групп полиса- [c.51]

В качестве последнего примера белков, связывающих малые молекулы, уместно рассмотреть лектины. Эти белки, чаще всего встречающиеся в растениях (но не только в них), связывают производные углеводов со значительной степенью стереоспецифичности. Впервые лектины привлекли внимание исследователей своей способностью агглютинировать эритроциты посредством связывания гликопротеинов мембран. Некоторые лектины специфичны к индивидуальным групповым веществам крови. Интерес к ним увеличился после того, как было обнаружено, что некоторые из лек-тинов агглютинируют преимущественно злокачественные клетки. Посредством иммобилизации на нерастворимом носителе типа агарозы лектины могут быть использованы для очистки гликопротеинов методом афинной хроматографии. Наиболее изученным лек-тином является конкавалин А для этого белка определены аминокислотная последовательность из 238 остатков и трехмерная структура. Конформация конкавалина А весьма примечательна. Семь участков его единственной полипептидной цепи формируют антипараллельную складчатую структуру, а шесть последующих участков образуют другую антипараллельную структуру, перпендикулярную первой. Ион Mn + координирован с двумя молекулами воды и боковыми радикалами Н18-24, 01и-8, Азр-Ш и Азр-14, образуя октаэдр. Ион Са +, расположенный на расстоянии 0,5 нм от Мп +, делит с ним два последних лиганда, а также связан с карбонильным кислородом Туг-12, боковым радикалом Айп-14 и двумя молекулами воды и также образует октаэдрическую конфигурацию. Остатки глюкозы и маннозы связываются в глубоком кармане размером 0,6 X 0,75 X 1,8 нм, образованным, как это ни удивительно, гидрофобными остатками. [c.562]

Возрастает применение афинной хроматографии на группоспецифических адсорбентах. Так, путем использования лиганда, специфичного в отношении группы ферментов, можно избежать ряда трудностей, присуш,их созданию более специфичного лиганда. При использовании такого, менее специфичного, адсорбента в афинной хроматографии несколько уменьшается селективность адсорбции, что, однако, можно компенсировать правильным подбором условий элюции [128]. Коферменты представляют собой почти идеальные группо-специфические лиганды, поскольку они обычно взаимодействуют с данной группой ферментов. У каждого из таких ферментов имеется по крайней мере два специфических центра связывания—-один для кофермента (общий для всех членов группы) и один (или более) — для данного специфического субстрата. [c.643]

I - з часток для амплификации ДНК соответствующей продукту синтеза 2 - рандомизованный фрагмент 3 - участок для амплификации ДНК 4 - аффинная колонка с иммобилизованным лигандом а - афинная хроматография и элюция б - обратная транскрипция а - амплификация I - транскрипция [c.307]

Для селективного выделения и очистки биологически активных веществ, в частности ферментов, применяют биоснецифическую (афинную) хроматографию [17], основанную на специфических силах сродства, лежащих в основе биологической функции фермента, В качестве сорбента используют специальные нерастворимые лиганды, которые избирательно связывают только определенные ферменты. Связь между молекулой фермента и лигандом осуществляется за счет нековалентных связей. Многосторонний контакт между молекулами фермента и лиганда, приводящий к высокой избирательности сорбции, обеспечивается определенным пространственным расположением функциональных групп фермента, связанным с его уникальной геометрической структурой, при этом имеет место соединение типа ключ — замок . [c.15]

Ионитные комплексы с сорбированными лигандами могут быть использованы для селективной сорбции ферментов и гормонов. С этой целью селективный к ферменту лиганд фиксируется на комплексе вследствие реализации координационной связи с ионами металла. Селективная к ферменту группа должна быть свободна и при контакте с ферментом происходит его избирательная сорбция (афинная хроматография ферментов) [19—21, 62]. Можно предполагать, что ионитные комплексы с сорбированными лигандами будут стабильнее тех, в которых лпганды фиксируются па сорбенте в результате образования водородной связи или нековалентных взаимодействий [53]. [c.310]

Афинная хроматография. Метод базируется на задерживании комплекса, образующегося из компонента разделяемой смеси и лиганда, который фиксирован на частицах носителя (наполнителя колоньси). При данном методе используются агенты, способные специфичесьси связывать какое-нибудь одно конкретное вещество. Папример, фермент очищают на колонке, заполненной его субстратом или специфическим ингибитором (таблица). [c.72]

Однако -нитрофенильную группу удалось заместить только на L-фенилаланин-п-нитроанилид или -лейцин-п-нитроанилид. Амидные связи в боковой цепи, которые образуются за счет специфической -аминокислоты, могут быть разрушены с помош,ью химо-трипсина как in vivo, так и in vitro. Платэ и Валуев [136] описали синтез афинных адсорбентов для биоспецифической хроматографии. Химическими методами осуществляется иммобилизация полимерных носителей путем связывания специфических лигандов с матрицей. После активации бромцианом протеин может быть связан с имидокарбонильной группой [c.101]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология