Ферменты термисторы

Калориметрические сенсоры основаны на миниатюрных калориметрах и применяются для растворов (разд. 7.5). В простейшем случае проба проходит через реактор, иа выходе которого тепло реакции измеряют термистором. Для определения субстратов (разд. 7.8) в реакторе иммобилизуют фермент. Такое устройство не является сенсором в строгом смысле нашего определения, поскольку контроль не непрерывен. Измерение теплового эффекта реакции стали практиковать, используя отдельные ферментативные реакции. Возможно определение мочевины, пенициллина, глюкозы, сахарозы, холестерина или лактата. [c.513]

Благодаря своей высокой специфичности ферменты давно применяются в области аналитической химии. Применение иммобилизованных ферментов способствует созданию методов без-реагентного анализа, позволяющих проводить практически непрерывный анализ водных растворов органических (а в ряде случаев и неорганических) соединений. В свою очередь достижения в этой области стимулируют развитие эффективных методов контроля окружающей среды, клинической диагностики и т. д. Созданные в недавнее время так называемые ферментные электроды применяются в быстром автоматическом анализе многокомпонентных систем. Наконец, разработаны чувствительные ферментативные методы с использованием термисторов, в том числе, и с ферментными термисторами . [c.16]

Наиболее простой подход использовали в термических ферментных датчиках [5, 30, 43]. в которых фермент иммобилизовали непосредственно на термодатчике (термисторе) либо путем сшивания, либо удерживая фермент в диализном мешке, надетом на термистор. К сожалению, большая часть тепла, выделявшегося при ферментативной реакции, рассеивалась в окружающем растворе и не улавливалась термистором. По этой причине чувствительность была низкой, и даже если этот недостаток был до некоторой степени преодолен в более поздних конструкциях [37, 42], термические ферментные датчики предназначались главным образом для серийных анализов. [c.458]

Большая часть тепла, выделяющегося в колонке с ферментом, уносится потоком жидкости. Температуру на выходе колонки измеряют небольшим термистором, смон- [c.458]

Ферментные термисторы и аналогичные им устройства успешно используют во многих областях биоанализа, например в клиническом анализе, контроле технологических, в том числе ферментационных процессов, контроле загрязнения окружающей среды. Недавно показана возможность их применения при хроматографическом определении ферментов в сложных смесях. Кроме того, на основе ферментного термистора разработана проточная система для иммуноанализа. В табл. 29.2 охарактеризовано большое число анализов, выполненных с помощью ферментных калориметров. Правда, следует иметь в виду, что некоторые из цитируемых здесь работ [c.462]

При незначительной модификации проточной системы ферментный термистор можно использовать для определения активности растворенного фермента. Исследуемый раствор фермента и раствор соответствующего субстрата (в относительном избытке) пропускают порознь через теплообменник затем их смешивают, быстро пропускают через один из коротких внутренних теплообменников для устранения тепла, выделяемого при смешении растворов, и направляют в реакционную камеру (объемом 1 мл). Последняя устанавливается вместо обычной ферментной колонки и представляет собой либо неактивную колонку, либо тефлоновую трубку, образующую реакционную спираль . Температуру на выходе реакционной камеры непрерывно измеряют одним из термисторных датчиков, как описано в разделе 29.2. Для большого числа разных ферментов обнаружена линейная корреляция между температурным откликом и активностью фермента [6]. Чувствительность метода-0,01-0,1 ед. активности/мл в зависимости от типа фермента. Калориметрическое определение активности растворенных ферментов может представить интерес для клинического анализа, а также для контроля процессов очистки ферментов. Хотя абсолютная чувствительность этого метода невелика, он имеет свои достоинства, так как позволяет проводить прямые непрерывные измерения в потоке. Его можно применять для анализа неочищенных проб, расходуя недорогие субстраты (здесь нет необходимости в дорогостоящих субстратах, дающих окрашенные продукты). [c.467]

В аналитических исследованиях в связи с иммобилизованными ферментами необходимо упомянуть ферментные электроды [21], ферментные термисторы [40] и ферменты, ковалентно связанные с полистиролом или найлоном для целей автоматического анализа [24, 46]. Гильбо [22], например, использовал ферментные электроды для определения глюкозы, мочевины, L-аминокислот, галактозы, ацетилхолина и дегидрогеназ. Ферхмеиты, связанные с капиллярными реакторами, использованы в соединении с автоанализатором фирмы Te hni on для анализа различных субстратов, таких как глюкоза, мочевина и мочевая кислота [55]. Гудзон и др. [20] описали применение иммобилизованной холинэстеразы для контроля воздуха и воды, для обнаружения ингибиторов фермента, таких, как пестициды. Система характеризуется чрезвычайной чувствительностью. Например, органофосфат параоксон может быть обнаружен в количествах 1 10 в воздухе и воде. [c.442]

Рис. 12. Микрокалориметрический датчик для анализа метаболитов с помощью иммобилизованных ферментов а — устройство измерительного блока I — крепление верхней и нижней части колонки 2 — металлический блок 3 — термистор 4 — микроколонка, заполненная иммобилизованным ферментом 5 — внутренняя часть блока 6 — водяная баня, 7 — теплообменник б — общая схема установки стрелками показано направление потока анализируемого раствора /— колонка с ферментом 2 теплообменник 3 — колонка сравнения 4 —

Использование ИФА в контроле биотехнологических процессов связано с измерением в мутных средах. В этом случае перспективен микрокалориметрический метод (иммунофермеитные термисторы) с ферментом глюкозооксидазой, а также электрохимические методы (иммунофермеитные электроды) с пероксидазой. Эти методы просты, не требуют сложного оборудования, легко поддаются автоматизации. [c.114]

Существенно большая эффективность определения теплоты реакции достигнута в системах, в которых использовали небольшие колонки с ферментом, иммобилизованным на частицах носителя. К таким системам относятся ферментный термистор [30, 32] и проточный энтальпиметрический анализатор с иммобилизованным ферментом [3]. Описана также комбинация серийного энтальпиметра с термостатируемой колонкой, содержащей иммобилизованный фермент [20]. В этих системах тепло переносится жидкостью, проходящей через колонку мимо термодатчика, вмонтированного в верхнюю часть колонки или на ее выходе. [c.458]

Смена колонок осуществляется очень легко колонку просто вставляют в нижний конец пластиковой трубки, служащей для установки колонки в прибор и содержащей выходной патрубок и термодатчик. Можно использовать колонки различного диаметра (максимальный внутренний диаметр 7 мм) и высоты ферментного слоя (максимум 30 мм). Носителем фермента может служить найлоновая трубка, намотанная на специальный адаптер, который вставляется в держатель колонки и связывает трубку с проточной системой. Найлоновая трубка удобна для анализа неочищенных проб, содержащих твердые частицы [27], но имеет низкую ферментную емкость. Обычно в качестве носителя используют пористое стекло с контролируемым размером пор, которое не только обладает высокой ферментной емкостью, хорошей механической прочностью, химической и микробной устойчивостью, но и позволяет применять сравнительно простые методики иммобилизации фермента. В ряде работ [7, 31] применяли и другие материалы. Разные носители существенно различаются по способности к адсорбции компонентов анализируемых растворов, что зависит, например, от реального распределения на их поверхностях ионных и гидрофобных групп. Поскольку такая адсорбция почти наверняка вызывает неспецифическое выделение тепла и даже может влиять на ферментативную реакцию, выбор материала носителя весьма существен. Хорошие результаты получаются при использовании пористого стекла с размерами пор от 500 до 2000 А и частиц-около 80 меш. Если используют необработанное или обработанное алкилпропиламином пористое стекло, полученное из разных источников, активация стекла глутаровым альдегидом с последующей иммобилизацией фермента почти всегда дает хорошие результаты. Следует отметить, что обычно в колонку термистора вводят довольно большой избыток фермента (нередко 100 ед. активности). Эта процедура обеспечивает стабильность работы и неизменность характеристик системы при большом числе проб и в случае длительных [c.460]

Если первая реакция слабо экзотермична, соответствующий ей фермент можно помещать в предколонку, находящуюся снаружи ферментного термистора, оставив внутри калориметра только фермент(ы), катализирующие последующие реакции. Это позволяет увеличить гибкость системы и повышает ее суммарную производительность, поскольку можно использовать более эффективные колонки с ферментами, особенно на первой стадии. Таким способом с помощью 3-глюкозооксидазы определяли цел-лобиозу [12], а с помощью (3-галактозидазы-лактозу [24]. Поскольку энтальпия гидролиза очень мала, для термических измерений использовали образующуюся при гидролизе глюкозу, окисляя последнюю в ферментном термисторе с глюкозооксида-за/каталазной колонкой. [c.462]

В настоящее время стала вполне доступной оксидаза из Pedi o us pseudomonas (ЕС. 1.1.3.2). Использование ее в описанных выше системах с рециклированием [40] позволяет достичь чрезвычайно высокой чувствительности (10 нМ). Разумеется, этот фермент можно использовать в ферментном термисторе, лучше в сочетании с каталазой, как в системе тлюкозооксидаза/каталаза. [c.466]

Быстрое ферментативное определение этанола представляет интерес как для клинической химии, так и для биотехнологии. В одной из недавних работ [18] сравнивали результаты определения спирта ферментным электродом на основе полярографического кислородного электрода и ферментным термистором в обоих случаях использовали один и тот же фермент - алкогольоксидазу из andida boidini (ЕС 1.1.3.13). Стабильность алкогольоксидазы на пористом стекле в ферментном термисторе за- [c.466]

Ферментный термистор успешно применяют в качестве инструмента специфического контроля в гель-фильтрации, ионообменной и аффинной хроматографии [11]. Поскольку ферментный термистор можно использовать для непрерывного определения активности ферментов непосредственно в неочищенных пробах, с его помощью можно идентифицировать и локализовать отдельные компоненты сложной хроматограммы, например на начальных стадиях процесса очистки фермента (рис. 29.4). Кроме того, в аффинной хроматографии при элюировании ферментам часто сопутствуют их коферменты, сильно поглощающие в УФ-области, что затрудняет непрерывный контроль за содержанием фермента по УФ-спектрам или спектрофотометрически регистрируемым изменениям концентрации NAD(P)H. Таким образом, в аффинной хроматографии калориметрическое определение активности элюированного фермента имеет определенные преимущества. [c.467]

В работе [27] пенициллин, присутствующий в бродильном бульоне, определяли с помощью системы с иммобилизованной пенициллиназой ((3-лактамазой). При иммобилизации фермента на пористом стекле диапазон определяемых концентраций охватывал по меньшей мере от 0,01 до 100 ммоль/л. В качестве носителя фермента опробовали также найлоновую трубку. На рис. 29.6 результаты определения пенициллина G в пробах бродильного бульона нанесены на градуировочную кривую для области низких концентраций. Коэффициент корреляции результатов, полученных калориметрическим и стандартным методом, составляет 0,997. Определение пенициллина ферментным термистором в производстве антибиотиков имеет явное преимущество по сравнению с обычно используемыми методами, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография и фотометрия. Несколько примеров успешного применения калориметрических методов вместо обычных приведено в работе [13]. [c.469]

Термоанализ можно применять также и для эпизодического или непрерывного наблюдения за окружающей средой [7] как своего рода антитоксический контроль. При необходимости детектирования определенного токсического соединения в ферментной колонке термистора можно иммобилизовать определенное количество фермента, который ингибируется данным соединением. Тяжелые металлы, например Hg(lI), можно обнаружить уже при содержании до 0,2-10 % по их ингибирующему действию на иммобилизованную уреазу [7]. Концентрацию тяжелых металлов в пробе определяют сравнением температурного отклика на импульсный ввод субстрата (с избытком мочевины) до и после введения пробы. Затем специальной промывкой полностью восстанавливают активность уреазы, что позволяет проводить повторные анализы на той же ферментной колонке. В некоторых случаях можно применять ферменты, которые действуют непосредственно на определяемое вещество. Так, цианид определяют с пределом обнаружения 10 М, используя фермент родаминазу. Возможно даже прямое определение пестицидов и ингибиторов ацетитхолинэстеразы [c.470]