Химотрипсин кинетика действия

Кинетика необратимой инактивации а-химотрипсина под действием ультразвука. [c.11]

Механизм действия сериновых протеиназ в настоящее время понят лучше механизма любого другого типа ферментов и может служить иллюстрацией некоторых важных моментов, касающихся ферментативного катализа. Гидролиз амида может показаться не слишком сложной реакцией химику-органику. В случае же ферментативного катализа для обеспечения успешного протекания реакции необходимо очень строгое обеспечение тех стадий, которые химик может счастливо игнорировать. В противном случае будет происходить замедление реакции. Даже механизм, приведенный на схемах (28) — (34) и насчитывающий 9 отдельных стадий, является, безусловно, упрощенным. [В качестве иллюстрации можно отметить, что в последних исследованиях механизма действия химотрипсина с использованием методов быстрой кинетики в водном диметилсульфоксиде при —90°С показано наличие четырех процессов, предшествующих образованию тетраэдрического интермедиата см. схему (28) . Первым из этих процессов является связывание субстрата, остальные, по-видимому, представляют собой индуцированные субстратом конформационные изменения в ферменте, необходимые для обеспечения правильной стереохимии катализа] [63]. Нетрудно понять, почему для катализа распада такой высоко энергетической частицы, как тетраэдрический интермедиат, требуется особое обеспечение такие стадии могут в конце концов быть скоростьопределяющими в самых простых реакциях. Однако в связи с тем, что для эффективного протекания ферментативного катализа необходимы очень [c.497]

Исследование субстратов с известной лимитирующей стадией. В большинстве случаев непосредственное определение характеристических времен реакции встречает экспериментальные трудности. При условии, что механизм реакции достаточно изучен для определения элементарных констант, можно воспользоваться данными стационарной кинетики. Так, для гидролиза сложноэфирных субстратов под действием а-химотрипсина лимитирующей является стадия гидролиза ацилфермента. Соответственно определяемая [c.82]

Например, этому уравнению подчиняются экспериментальные данные работы (Sodetz, astellino, 1972), в которой исследовалась предстационарная кинетика действия плазминов. Аналогичные данные получены в работе Бендера и соавторов при изучении кинетики гидролиза л-нитрофенилацетата под действием а-химотрипсина. Эти факты говорят о том, что механизм катализа включает промежуточные соединения, предшествующие ацилированию [c.80]

Интересные экспериментальные результаты получены при изучении конформационных изменений белка, сопряженных с изменением pH и перераспределением зарядов на белковой глобуле. Как правило, инактивация ферментов существенно возрастает или замедляется в сильнокислых или щелочных растворах. В работе Клибанова, Мартинека, Березина (1974) проведено изучение кинетики инактивации химотрипсина под действием ультразвука. В диапазоне концентраций фермента 10 —10 М кинетика инактивации достаточно строго описывается одноэкспоненциальным уравнением типа (5.4), (5.9), (5.12) или (5.15) (рис. 38). Исследование кинетики инактивации а-химотрипсина ультразвуком показало, что скорость инактивации резко падает при кислых и ще- [c.97]

Рис. 38. Кинетика инактивации а-химотрипсина под действием ультразвука а — изменение активности б — линейная анаморфоза в полулогарифмических координатах и определение k (Клибанов, Мартинек, Березин, 1974)

Одним из первых ферментов, для которого было показано образование ковалентного фермент-субстратного интермедиата, является химотрипсин при действии этого фермента на п-нитрофе-нилацетат происходит быстрое освобождение п-нитрофенола и последующее значительно более медленное освобождение ацетата. Наблюдаемую кинетику процесса удалось объяснить, когда был выделен и охарактеризован ацилферментный интермедиат, устойчивый при низких pH. Установлено, что ацетилирование происходит по гидроксидной группе серина-195 фермента. Таким образом, гидролиз п-нитрофенилацетата протекает по крайней мере в три стадии [c.294]

Рентгеновские исследования комплексов химотрипсина с субстратоподобными ингибиторами сыграли принципиальную роль в установлении структурных предпосылок каталитической функции его активного центра (см. 2 этой главы). Однако для выяснения динамических аспектов действия активного центра оказались особенно плодотворными подходы химической кинетики (см. 5,6 этой главы). Успехи кинетических исследований были во многом предопределены открытием М. Бергмана и Д. Фрутона и позднее Г. Нейрата и их сотрудников, которые установили, что химотрипсин способен гидролизовать не только сложные белковые молекулы, но также и простые низкомолекулярные синтетические субстраты (амиды, сложные эфиры и др.) [20]. [c.127]

Попытка обобщить данный материал сделана в настоящей книге, которая представляет собой логическое продолжение первой части, опубликованной ранее отдельным томом и посвященной анализу специфичности и кинетических аспектов действия ферментов на относительно простые субстраты, такие как алифатические и ароматические спирты и альдегиды, производные карбоновых кислот, замещенные аминокислоты и их производные (не выше ди- или три-пептидов). Главное внимание в первой части книги уделялось характеру фермент-субстрат ных взаимодействий на достаточно ограниченных участках активного центра и кинетическим проявлениям этих взаимодействий. В основе первой части книги лежит экспериментальный материал, полученный при изучении специфичности, кинетики и механизмов действия цинк- и кобальткарбоксипеп-тидазы, химотрипсина и трипсина из поджелудочной железы быка, алкогольде-гидрогепаз нз печени человека и лошади и пенициллинамидазы бактериального происхождения. Итогом первой части книги явились обобщение и формулировка кинетико-термодинамических принципов субстратной специфичности ферментативного катализа. [c.4]

Тщательное исследование рН-функций оказалось весьма ценным при изучении механизма действия гидролаз. Возможность изолировать индивидуальные кинетические стадии с помощью методов остановленного потока, стационарной кинетики и релаксационной техники позволила получить вполне четкие результаты. Наиболее определенные данные при использовании некоторых субстратов были получены для трипсина и химотрипсина [2,3]. Именно с помощью такого подхода впервые было уста-йовлено участие остатков гистидина в механизме действия химотрипсина на стадиях ацилирования и деацилирования. Некоторые данные стационарной кинетики привели к полезным выводам о механизме действия негидролитических ферментов. Можно думать, что этот метод анализа механизмов ферментативных реакций будет быстро развиваться. Группа Альберти [4] провела очень тщательное измерение величин р/С и энтальпии ионизации связывающих группировок фумаразы. Данные о [c.217]

Рис. 23. Кинетика образования п-нитрофенола в реакции гидролиза п-нитрофенилацетата под действием а-химотрипсина. Концентрация фермента, соответствующая кривой I, в два раза меньше, чем на кривой 2 (Hartley, Kilby, 1952)

Начальная быстрая реакция может быть исследована струйным методом. Применив этот метод, чтобы проследить как стадию реакции, предшествующую стационарному состоянию, так и стадию, соответствующую устойчивому состоянию, удалось показать, что кинетика реакции отвечает приведенной выше схеме 393]. Для первой стадии, заключающейся в быстрой адсорбции субстрата на ферменте, константа скорости (k ), по-видимому, больше, чем 10в секг моль . Для второй стадии — ацилирования фермента и одновременного освобождения л-нитрофенола (Pi)—константа равна 3 селг. Третья стадия состоит в отщеплении ацетата (Рг)и реактивации фермента, причем константа скорости равна 0,0254 се " [393]. При использовании в качестве субстратов /г-нитрофенилацетата и 2,4-динитрофенилацетата было найдено, что константа скорости реакции 2 и Аз зависит от pH, причем h зависит от группы с кажущейся константой ионизации 6,7, а Аз зависит от группы с кажущейся константой ионизации 7,3 389] или 7,4 (377]. При pH 6,6 фермент в целом переносит от буфера на ацилирование химотрипсина /г-нитрофенил-ацетатом 0,5 протона (389]. Если бы имидазольная группа заметно ацилировалась, то при этом значении pH можно было бы ожидать отщепления протонов под действием фермента. [c.144]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология