Белки критерии чистоты

Разработанные к настоящему времени методы разделения исключительно эффективны, однако лишь их комбинированное применение приводит к получению белков, удовлетворяющих необходимым критериям чистоты. [c.346]

Правило фаз и фазовые диаграммы были с успехом использованы при изучении растворимости белков. Кривые растворимости оказались особенно полезными при определении чистоты белковых препаратов. Среди различных используемых в белковой химии физических критериев чистоты, включающих гомогенность при ультрацентрифугировании или при электрофорезе, критерий постоянства растворимости белка остается основным надежным показателем, если только белок не полимеризовался и не образовал прочных комплексов с другими компонентами смеси. На растворимость белка в данном растворителе влияют многие факторы наиболее важными из них являются ионная сила, температура и pH. [c.161]

При определении строения природных продуктов очень важным критерием является чистота исходного материала. Ранее критерий чистоты белков определялся произвольной растворимостью белков, [c.386]

Кристалличность. Несколько раз перекристаллизованные низкомолекулярные органические соединения обычно считаются чистыми. Ранее полагали, что этот критерий чистоты можно использовать и для белков. Позднее, [c.82]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

Различие в скоростях, с которыми разные органические ионы движутся к катоду или аноду иод влиянием электрического поля, дает возможность разделять сложные смеси органических веществ, например гидролизаты белков, сыворотку крови, нуклеиновые кислоты и сахара. Скорость перемещения ионов не всегда можно считать критерием чистоты. [c.49]

При растворении полидисперсных полимеров различие критических условий растворения для различных фракций может вызвать переход в раствор не всей навески полимера, а некоторой непостоянной части фракций. Вследствие этого возможна зависимость растворимости полимеров от количества навески (правило осадков, по Оствальду), тогда как в истинных растворах чистых низкомолекулярных веществ растворимость не зависит от количества твердой фазы на дне сосуда. Это расхождение, которое ранее казалось характерной чертой коллоидных растворов, было устранено, когда удалось показать, что для однородных, хорощо фракционированных препаратов полимеров растворимость также является постоянной величиной, не зависящей от количества навески более того, для белков, которые могут быть получены строго монодисперсными и очищенными, постоянство растворимости является одним из чувствительных критериев чистоты препаратов. [c.166]

Критерий чистоты белков [c.14]

Современное развитие химических и биологических наук истребовало более глубокого проникновения в существо изучаемых процессов, детального анализа химического состава разнообразных смесей и биологических объектов. Кроме того, для химического и биотехнологического ироизводства, в том числе для промышленности лекарственных средств, характерны постоянное возрастание требований к чистоте выпускаемых продуктов, ужесточение методов контроля, тенденция к использованию количественных критериев ири оценке качества. Поэтому помимо оценки интегральных характеристик, присущих объекту исследования в целом, часто требуется детальное изучение содержания отдельных компонентов, определяющих состояние биологических систем либо качество химических продуктов. Рещение этих задач, как правило, невозможно без применения достаточно эффективных методов разделения сложных смесей. Среди таких методов доминирует хроматография. Бурно развиваясь в последние десятилетия, этот метод открыл возможности разделения смесей, содержащих десятки и сотни компонентов, их качественного и количественного анализа, препаративного выделения индивидуальных веществ. Принципы хроматографии весьма универсальны, благодаря чему она оказалась пригодной для изучения объектов самой различной природы — от нефти и газов атмосферы до белков, нуклеиновых кислот и даже вирусов. Этим объясняется огромный интерес представителей различных научных и технических дисциплин к хроматографическим методам. Только в пяти специализированных международных журналах по хроматографии ежегодно выходит в свет свыше 2000 публикаций ио различным вопросам теории и применения метода, общее же их число в несколько раз больше. [c.5]

Один из критериев чистоты белка состоит в том, что при электрофорезе чистый белок дает только одну полосу. Если белок, считавшийся ранее чистым препаратом, при электрофорезе дает две полосы, то это означает, что он не гомогенен. При этом не исключено, конечно, что он представляет собой смесь субъединиц с различной степенью полимеризации, однако такие случаи являются скорее исключением, чем правилом. Смесь, которая не разделяется при некоторых заданных условиях электрофоретического эксперимента, можно разделить в других условиях, например если изменить значение pH при проведении электрофореза или попользовать метод седиментации в поле центробежных сил. Для того чтобы с уверенностью считать белок чистым, необходимо его проверить не по одному, а по нескольким критериям гомогенности. [c.401]

Лишь очень немногие очищенные белки удовлетворяют строгому критерию чистоты, основанному на правиле фаз, и было бы удивительно, если бы нашлось такое производное белка, которое при растворении вело бы себя столь идеально. [c.340]

Очистка воды или водных растворов, например буферного раствора, применяемого для определения молекулярного веса белков, фильтрованием или центрифугированием уже не дает удовлетворительных результатов. Они могут быть очищены ультрафильтрацией через нитроцеллюлоз-Рис. 61. ную мембрану [38] Вообще легче очистить Прибор для водные растворы солей, чем чистую воду, про-мывания Критерием чистоты растворителей являет-кювет коэффициент асимметрии, который не [c.160]

Понятие чистоты, естественно, относительно, и единственная зона может быть результатом того, что примеси присутствуют в слишком малых количествах, чтобы их можно было определить. Поэтому для проверки чистоты используют большие количества белка. Поскольку предел определения вещества при окрашивании составляет около 1 мкг, для гарантированной 99%-ной чистоты следует наносить 100 мкг белка, причем это количество будет достаточным только в том случае, когда вещество в качестве примеси содержит только один белок Даже при очень высоких концентрациях (0,5—1,0 мг) наличие одной зоны еще не является критерием чистоты, поскольку примеси могут не отделяться в выбранном буфере или при данном pH. Следовательно, для того чтобы иметь хотя бы некоторую уверенность в гомогенности препарата, обычно необходимо использовать несколько буферов и ряд значений pH. [c.236]

В последние годы, помимо обычных физических и химических критериев, поведение белков при хроматографировании стали использовать как важную характеристику для оценки чистоты белков. Опубликовано несколько превосходных обзорных статей по хроматографии белков [94, 122]. Разделение белков хроматографическими методами усложняется склонностью многих белков денатурироваться во время хроматографирования. Это ограничивает исследование мягкими адсорбентами и средами, свободными от таких детергентов и других органических растворителей, которые в других случаях являются желательными проявителями. Чувствительность методики была продемонстрирована рядом тщательно проведенных исследований. [c.331]

В тех случаях, когда макромолекулы отдельных фракций имеют резко различную степень разветвлен ности, указанный (нормальный) порядок осаждения отдельных фракций нарушается, так как растворимость высокомолекулярного соединения зависит не только от величины его макромолекул, но и от степени их разветвленности. Различная растворимость монодисперсных фракций приводит к тому, что растворимость полидисперсного высокомолекулярного соединения зависит от величины его навески. Растворимость монодисперсных высокомолекулярных соединений, как и растворимость низкомолекулярных веществ, не зависит от величины навески. Поэтому постоянство растворимости того или иного белка (при одних и тех же условиях) является одним из важнейших критериев его монодисперсности (т. е. чистоты). [c.363]

Для оценки степени чистоты (гомогенности) выделенного белка одним нз наиболее надежных методов является проба на постоянство растворимости. Эта проба основана на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. При растворении смеси веществ растворимость каждого индивидуального вещества не зависит от других веществ, находящихся в смеси. Состав растворившейся и нерастворившейся частей смешанного белкового препарата будет поэтому различным. Следует также иметь в виду, что кристалличность белкового препарата не может служить критерием гомогенности. [c.16]

Один из наиболее трудных вопросов, стоящих перед исследователем при очистке белка, это вопрос о том, когда можно считать очистку законченной. Иными словами, как узнать, что белковый препарат гомогенен Существует ряд критериев для определения чистоты препарата. [c.82]

Постоянная трудность, возникающая при изучении белков,— это отсутствие надежного критерия, по которому можно было бы судить о степени чистоты очищенных препаратов белка. Долгое время критерием гомогенности считали кристаллическое состояние препарата в очень немногих случаях прибегали к тестам количественной растворимости. Минимальные требования, предъявляемые к белковым препаратам,— это их относительная гомогенность по таким критериям, как данные, полученные методами хроматографии и электрофореза на колонках при различных значениях pH, а также данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге. Две главы книги посвящены описанию методов хроматографии и электрофореза белков на колонках. В книгу не включено обсуждение метода ультрацентрифугирования, так как данные по этому вопросу можно найти в специальных руководствах. Ввиду небольшого объема книги не включено также описание некоторых сложных приборов, например аппарата для противоточного распределения. [c.7]

Степень очистки данного компонента выражают отношением содержания этого компонента к общему содержанию белка (или к общему весу исходного вещества). Так как свойства чистого компонента редко известны заранее, то указанное отношение обычно выражают в произвольных единицах (например, в единицах на миллиграмм белка) и очистку продолжают до тех пор, пока не прекратится дальнейшее возрастание этой величины. В случае необходимости постоянство указанного отношения принимают в качестве критерия степени чистоты, однако компоненты смеси целесообразно подвергать возможно большему числу контрольных испытаний. С помощью специфических реакций на каждое из предполагаемых в качестве примесей веществ можно показать, в какой степени данный препарат освобожден от этих примесей чем больше сделано таких проб, тем больше вероятность того, что препарат является действительно чистым. [c.21]

Если белки являются соединениями в самом строгом смысле слова, как это понимается в органической химии, то их аминокислотный состав должен быть постоянным. В случае чистого белка аминокислотный состав твердой фазы должен быть постоянным и совпадать с аминокислотным составом растворенного белка, находящегося в равновесии с твердой фазой. До сих пор, однако, этот критерий ни разу не применялся при рассмотрении чистоты белка. [c.211]

Существует ряд методов, с помощью которых удается разделить белковые комплексы на фракции и выделить чистые индивидуальные белки. Критерием чистоты белков служат следующие показатели получение белка в кристаллическом состоянии (однако при этом следует иметь в виду, что некоторые белки образуют смешанные кристаллы) дальнейшая неразделяемость при электрофорезе и ультрацентрифугировании независимость растворимости от количества твердой фазы постоянство аминокислотного состава определенный молекулярный вес для многих белков — постоянство специфических биологических свойств (ферментативная активность, гормональная активность и т. п.). [c.10]

Другой тест на чистоту вытекает из диаграммы растворимости в случае гомогенного белка вплоть до достижения точки насыщения количество добавленного и количество растворившегося белка связань линейной зависимостью. Критериями чистоты также служат аминокислотный состав, изоэлектрическая точка, а также в некоторой степеии кристаллизуемость. В случае биологически активных белков, например. ферментов, вывод о чистоте может быть сделан из критериев активности (субстратная специфичность, оптимальные pH и температура, кинетические эксперименты). [c.354]

Каждый биохимик, получив исследуемый фермент в кристаллическом виде, испытывает большое и вполне законное удовлетворение. Однако не следует забывать, что одна только кристаллизация фермента не может служить полной гарантией его чистоты. Так, Джекоби, в лаборатории которого за три года было выделено в кристаллическом виде 50 белков [7], сообщил о кристаллизации препаратов всего лишь 30%-ной чистоты. Он еще раз подчеркнул необходимость применения иных критериев гомогенности, таких, например, как ультрацентрифугирование и электрофорез. Однако следует иметь в виду, что при некритичном отношении к постановке эксперимента и на ультрацентрифуге можно получить один пик для гетерогенной смеси. На скорость седиментации частиц в центробежном поле и характер получающихся на седиментационных диаграммах пиков влияет ряд факторов, которые рассматриваются в настоящей книге и которыми некоторые исследователи часто на собственный риск пренебрегают. Именно по этой причине, несмотря на большие возможности применения этого метода в упомянутых выше областях, во многих лабораториях к работе на ультрацентрифуге допускается лишь ограниченный круг лиц, умеющих правильно использовать приборы и интерпретировать получаемые данные. Люди, владеющие этими знаниями, охотно принимаются в исследовательские коллективы, и можно надеяться, что предлагаемая книга послужит увеличению числа таких специалистов. Материал, изложенный в данной книге, рассмотрен достаточно глубоко, но вместе с тем не слишком сложно, что является результатом многолетнего опыта замечательного лектора, читающего курс физико-химических концепций студен-там-биохимикам. [c.10]

Белки относятся к числу наиболее сложных и больших молекул, созданных природой кроме того, они остаются в числе наименее устойчивых и трудно поддающихся очистке. Эти свойства преподносили почти непреодолимые технические трудности первым исследователям в данной области и добавляли к этому нежелательное сходство химии белков с коллоидами. Долгое время белки относили к неопределенным коллоидам, молекулы которых трудно выделить и охарактеризовать. Однако по мере того, как совершенствовались критерии чистоты белков, возникал вопрос о молеку лярной концепции в белковой химии в конце концов пришли к тому, что белки представляют собой только большие сложные молекулы, растворы которых не менее молекулярны, чем растворы их компонент — аминокислот. Признанию этой точки зрения в большой мере способствовали работы Сведберга, Серенсена и других. [c.217]

Методы исследования, рассмотренные в предыдущих разделах, непригодны для высокомолекулярных соединений. Понятие чистоты и идентичности таких веществ, как нуклеиновые кислоты и белки, должно включать не только идентичность носледователь-ности субъединиц, но и идентичность в организации и пространственном расположении полимерных цепей. Перечисленные Снрин-голлом [471 критерии чистоты для белков могут служить иллюстрацией обычно применяемых тестов. Они включают 1) однозначность электрофоретической подвижности в диапазоне pH, в котором вещество обладает устойчивостью 2) однозначность скорости седиментации при ультрацентрифугировании 3) концентрационные изменения в системе раствор — растворитель, подчиняющиеся гауссовскому распределению 4) независимость растворимости в инертном растворителе от количества нерастворенного вещества, находящегося в контакте с раствором. [c.31]

Частичная очистка белков и полипептидов может быть достигнута осаждением концентрированными растворами солей, органическими растворителями или путем образования определенных соединений [31, 175]. Для очистки применяются также физические методы ультрацентрифугирование [175], электрофорез [179] и противоточное распределение [36, 187]. При любом методе очистки необходимо иметь критерий гомогенности белка или пептида. Даже кристаллическое состояние не может служить однозначным критерием чистоты [166]. В литературе имеются данные, которые дают возможность предположить, что многие высокоочищенные белки микрогетерогенны [32]. Тесты на гомогенность обычно включают иммунологические испытания, ультрацентрифугирование, электрофорез, диффузию, хроматографию и определение ферментативной или биологической активности [32]. [c.387]

Метод противоточного распределения, разработанный Крейгом [36], был применен для разделения смесей аминокислот и очистки белков [187]. Так как полярные группы, определяющие растворимость аминокислот, одинаковы для различных аминокислот, коэффициенты распределения аминокислот различаются незначительно, и, следовательно, их разделение становится трудной задачей. При ацетилировании [172] или образовании нипсиль-ных производных (/г-иодфенилсульфонилпроизводные) [94] фракционирование облегчается за счет уменьшения влияния полярных групп. Хроматографические методы значительно более эффективны по разрешающей способности, но они ограничены возможностью выделений сравнительно небольших количеств веществ. Успешное применение метода противоточного распределения зависит в значительной степени от подходящего выбора двухфазной системы растворителей. Кроме того, применение этого метода ограничивается возможностью разделения веществ низкого молекулярного веса 10 ООО), за исключением тех случаев, когда пептиды обладают большой устойчивостью к денатураций. В присутствии большинства двухфазных систем растворителей, как правило, легко происходит денатурация белков. Однако при нахождении благоприятных условий противоточное распределение-имеет преимущество по сравнению с другими методами, так как при этом возможно рассчитать коэффициенты распределения компонентов, которые могут быть установлены с большой точностью. Профиль кривой распределения дает хороший критерий чистоты вещества. [c.397]

Другим критерием чистоты является раст воримостъ, так как известно, что растворимость чистого вещества не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Однако применение этого метода наталкивается на ту трудность, что растворимость белков сильно изменяется в присутствии следов кислот, оснований или солей этот недостаток устраняют, применяя в качестве растворителя концентрированный солевой раствор. При этом было установлено, что некоторые белки, считавшиеся однородными, в действительности представляют собой смеси очень сходных веществ (например, яичный альбумин и карбоксигемоглобин), тогда как другие, безусловно, являются индивидуальными веществами (например, два кристаллических фермента — химотрипсиноген и рибо-нуклеаза). [c.417]

I Кривые растворимости. Одним из более надежных критериев чистоты белка является форма кривых растворимости. Кривые растворимости строят, тщательно измеряя количество белка в растворе при различных количествах белка, добавленного в раствор. Ионная сила, температура и объем раствора ДО.ИЖНЫ при этом оставаться постоянными необходимым условием является также достижение полного равновесия между твердой и растворенной фазами. Для чистого белка зависимость количества белка в растворе от количества внесенного белка строго линейна до точки насыщения после точки насыщения наклон кривой равен нулю. На фиг. 26 приведены кривые растворимости для чистого и загрязненного препаратов протеолитического фермента пепсина. Присутствие примесей может различным образом изменять идеальную кривую в зависимости от растворимости загрязняющего вещества и от его содержания в препарате. Однако и самое тщательное исследование формы [c.82]

Электрофоретическое исследование. Хорошим критерием чистоты белка является вид электрофореграммы, полученной при разных значениях pH (особенно если электрофорез проводят в крахмальном или в полиакриламидном геле). Электрофореграмма, так же как и седиментограмма, должна содержать один симметричный пик, ширина которого соответствует коэффициенту диффузии белка. [c.83]

В качестве критерия чистоты соединения пользуются также растворимостью. Известно, что растворимость гомогенного вещества постоянна и не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Этот метод вряд ли пригоден для определения растворимости белков в чистой воде, так как растворимость белков в воде сильно зависит от следов электролитов и от концентрации водородных или гидроксильных ионов. Влияние этих веществ можно исключить, если в качестве растворителя использовать концентрированный раствор соли. При проверке растворимости кристаллического яичного альбумина или карбокси-гемоглобина в растворе сернокислого ам1мония было найдено, что растворимость до некоторой степени зависит от количества твердой фазы [22]. На этом основании было сделано заключение, что молекулы этих белков можно рассматривать как системы обратимо диссоциирующих компонентов. Очень тщательные определения растворимости кристаллического химотрипсиногена [23] и рибонуклеазы [24] показали, что эти белки ведут себя как гомогенные соединения. В высшей степени важно, что эти гомогенные белки являются ферментами (см. гл. ХП). [c.15]

Для вирусов с хорошо установленным элементарным химическим составом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяют обнаруншть примеси, содержащие азот или фосфор, если они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоятельствах могут быть применепы также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющий обнаружить всего-навсего одну аминокислоту. Можпо также использовать метод отпечатков пальцев для разделения пептидов триптического гидролизата хорошо охарактеризованных вирусных белков, но чувствительность его как критерия чистоты также невысока. [c.48]

Ввиду неопределенности критериев и трудности определения чистоты белка целесообразно выбрать другой путь исследования, а именно сравнительный анализ. Этот метод позволяет обнаружить, какие группы определяют функцию одинаковых белков (например, инсулина) различных биологических видов. Такой метод исследования имеет большое преимущество, если его сочетать с изучением ингибирующего действия. Еще одним путем исследования может быть анализ белков, близких по выполняемым функциям. Например, вое ферменты гликолитического цикла являются более или менее исследованными для каждого последующего фермента субстратом является продукт, образующийся в результате действия предыдущей системы ферментов. Сравнение тех ферментов гликолитического цикла, которые катализируют перенос атомов водорода (например, изомераза) или фосфатных групп (например, гексокиназа, фосфогексокиназа и дифосфогли-церофосфокиназа), представляло бы особый интерес, потому что каждая такая группа ферментов может иметь много общих структурных особенностей. С этой точки зрения можно рассматривать также соответствующие ферменты гликолитического цикла в дрожжах и мышцах. [c.251]