Сахарозный градиент

Дальнейшие данные были получены с помощью актиномицина D [126]. РНК, экстрагированная из асцитных опухолей Кребс II и отцентрифугированная затем в сахарозном градиенте, образует три пика, поглощающих при 256 ммп. При идентификации оказалось, что пики эти соответствуют РНК с константами седиментации 30S, 19S и 4S. Если клетки в течение короткого времени (20 мин) инкубировать с уридином, меченным тритием, то радиоактивность обнаружится только в двух пиках меньшая — в пике 4S-PHK (растворимая РНК) и большая — в очень небольшом пике 40S-PHK. Обычные клетки и клетки, зараженные вирусом ЕМС, дают аналогичные результаты. При более длительной инкубации (2 час) радиоактивность находят не только в пике 40S-PHK, но и в трех пиках, поглощающих в ультрафиолете. Такая же картина наблюдается в зараженных клетках. [c.247]

Для того чтобы отделить рибосомы от полисом, был использован метод центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Этот метод позволяет разделять материалы, осаждающиеся с разными скоростями в сильном гравитационном поле, и заключается в следующем. Пластмассовую центрифужную пробирку наполняют раствором сахара, концентрация которого плавно меняется, например от 30% на дне пробирки до 15% в верхнем слое. Для получения градиента медленно наполняют пробирку из двух сосудов, содержащих 15-процентный и 30-процентный раствор сахарозы. По мере наполнения количество приливаемого 30-процентного раствора убавляют, а 15-процентного — прибавляют. Испытуемый материал, состоящий из молекул различной величины, осторожно наслаивается поверх раствора сахара, после чего пробирку помещают в ротор центрифуги. Сахарозный градиент сохраняется во время центрифугирования и после него за счет силы тяжести. Во время центрифугирования молекулы разного размера проходят неодинаковое расстояние и остаются разделенными и после центрифугирования. Дно пластмассовой пробирки можно проколоть и собрать отдельные фракции, а затем их проанализировать. [c.310]

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ РНК В САХАРОЗНОМ ГРАДИЕНТЕ 127 [c.127]

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ РНК ПУТЕМ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В САХАРОЗНОМ ГРАДИЕНТЕ [c.127]

Выражение градиент плотности сахарозы , часто встречаюш,ееся в литературе, является точным, но длинным. Название сахарозный градиент означает градиент копцентрации сахарозы, а это в сущности и ость градиент плотности раствора. Мы будем пользоваться названием сахарозный градиент, чтобы не спутать его с равновесным градиентом плотности, о котором уже упоминалось ранее. [c.127]

Фпг. 1. Системы для приготовления линейных сахарозных градиентов. [c.128]

При использовании сахарозного градиента для препаративных целей образец, по-видимому, следует наносить по методу Бриттена и Робертса [c.132]

При таком приготовлении градиента образца следует иметь в виду, что градиент РНК должен быть не выше обратного ему градиента сахарозы, иначе такая система не будет стабильной. Для тех, кто желает использовать максимальную емкость сахарозных градиентов в препаративных целях, мы приводим пример расчета, позволяющего определить емкость градиентов. [c.133]

Фиг. 2. Разделение рибосомных РНК путем центрифугирования в сахарозном градиенте.

Значения параметра к (и fe) для скоростного зонального центрифугирования, вычисленные для сахарозного градиента 5—20% при 5 °С (данные фирмы Be kman Instruments In .) [c.197]

Установлено, что темп синтеза РНК в эмбриональном развитии изменяется неравномерно он весьма мал до 6-го часа развития икры и резко увеличивается после того момента, когда ядра впервые обнаруживают морфогенетическую активность. Было также показано, что все высокополимерные РНК, синтезируемые в период раннего эмбрионального развития вьюна (до средней гаструлы), представляют собой информационные РНК-Это видно из сопоставления распределения ультрафиолет-погло-щающего и радиоактивного материала в препаратах РНК, разделенных по величинам молекулярного веса путем ультрацен-трифутирования в сахарозном градиенте (см. рис. 1). Несовпадение пиков поглощения с пиками радиоактивности в области высокополимерных РНК (фракции № 1—35) показывает, что меченая, т. е. новообразованная, РНК не является рибосомной РНК и обнаруживает распределение молекулярных весов, свойственное иРНК- Информационная природа этих новообразованных РНК была показана нами путем гибридизации соответствующих седиментационных фракций РНК с денатурированной ДНК, иммобилизованной в агаровом геле [8]. [c.176]

По окончании центрифугирования сахарозный градиент можно фракционировать при помощи серийного прибора или вручную, что гораздо дешевле (см. рис. 10.3). В резиновую пробку, точно подходящую по размеру к центри4ч>жной пробирке, вставляют короткую стеклянную трубку, соединенную с резиновой трубкой. При помощи, этого приспособления мож— [c.234]

Одним из самых простых и широко распространенных методов фракционирования нуклеиновых кислот и других макромолекул является центрифугирование в сахарозном градиенте. Раствор с градиентом копцентрации сахарозы служит одновременно песуш,ей и стабилизуруюш ей средой, через которую движутся макромолекулы под действием центробежной силы. 1)лагодаря наличию непрерывного градиента концентрации сахарозы возможность перемешивания компонентов при встряхивании и других механических воздействиях сводится к минимуму. Этому способствует также и довольно высокая вязкость растворов сахарозы. Поэтому прп центрифугировании в сахарозном градиепте можно добиться значительно лучшего разделения смеси, чем при центрифугировании в обычном буфере. [c.127]

Наномним, что нри центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не ни различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, п при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэ/ому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифуг гированием в градиенте солей цезия, которое широко иснользуется для разделения молекул по их плавучей плотпостп. [c.127]

Типичные устройства для ]1риготовлеиия линейных сахарозных градиентов показаны па фиг. 1 (схема). Оба эти устройства изготовлены из [c.128]

Отводную трубку опускают в цептрифужную пробирку и прислоняют к внутренней стенке так, чтобы эта трубка все время находилась чуть выше уровня раствора, наполняющего эту пробирку. Поскольку в ходе формирования градиента концентрация сахарозы в растворе постепенно снижается, то в пробирке мепее концентрироваиный раствор наслаивается на слои более концентрированного раствора таким образом формируется непрерывный градиент плотности. Если С] орость вытекания жидкости из смесителя достаточно мала, то существенного перемешивания раствора сахарозы в центрифужной пробирке пе происходит. Насколько мне известно, оптимальная скорость наполнения пробирки сахарозным градиентом еще не установлена, однако принято считать, что продолжительность нриготовления одного градиента составляет 10—15 мин. Если экспериментатор пон елает проверить свой собственный метод приготовления градиента, то ему потребуется только расфракционировать градиент так, как это будет описано далее, и определить коэффициент преломления каждой фракции. [c.129]

За исключением особых случаев, для уменьшения пуклеазиой активности сахарозные градиенты рекомендуется охлаждать перед использованием и центрифугировать их на холоду. В этом отношении приготовление градиентов в холодной комнате не дает особого выигрыша, поскольку их все равно приходится оставлять на некоторое время для того, чтобы в результате диффузии исчезли локальные искажения концентрации и градиент выровнялся в целом. Если градиенты предполагают использовать сразу же вскоре после приготовления, то их можно быстро охладить в ледяной бане. Если же градиенты используют не сразу, то их можно оставить в холодильнике на несколько часов. Отличное разделение РНК может быть, получено при центрифугировании даже в таких сахарозных градиентах,, которые были приготовлены за 24 час перед их использованием. [c.130]

Сахароза. Для разделения РНК чаще всего используют градиенты концентрации сахарозы от 15 до 30% или от 5 до 20% имеются сведения об использовании также и других сахарозных градиентов, например градиентов концентрации от 10 до 40% сахарозы. По-видимому, оптимальная разница концентраций сахарозы в градиенте может варьировать в зависимости от природы разделяемой РНК и цели опыта. В нашей лаборатории мы обычно используем градиенты от 15 до 30% сахарозы. В этих градиентах оба вида рибосомных РНК разделяются несколько лучше, чем в градиентах от 5 до 20% сахарозы. Время центрифугирования, необходимое для максимального разделения 18S- и 28S-PHK (мы обычно работаем на роторе SW25 при 25 ООО об1мин и температуре 0—5°), составляет 17—18 час. Это означает, что центрифугирование можно начать довольно поздно во второй половине дня и закончить утром следующего дня. [c.130]

При использовапии сахарозного градиента для аналитической цели количество наносимой РНК очень мало (менее 500 мкг), и поэтому при наслаивании образца на поверхность приготовленного в центрифужной иробирке градиента обычно не возникает никаких трудностей. Конец пипетки, содержащей образец, прислоняют к внутренней поверхности боковой Стенки центрифужной пробирки и осторожно опускают его по стенке до тех пор, пока он не коснется поверхности градиента. Если пользоваться полуавтоматической пипеткой, то образец мон<но аккуратно наслоить на поверхность сахарозного градиента без заметного перемешивания. Весьма желательно (хотя и не обязательно) растворять образец РНК в том же буфере, что и сахарозу. Однако важным условием, которое следует выполнять, является то, что плотность раствора образца должна быть меньше плотности раствора сахарозы в поверхностном слое градиента. 1 роме того, между комнонентами градиента и раствора образца не должно происходить никаких химических реакций, которые могли бы изменить градиент или РНК. [c.132]

Эти расчеты можно использовать только как самые предварительные, поскольку сразу же после начала центрифугирования на градиент концентрации образца будут влиять по крайней мере два других фактора. Первый из них выявляется в тот момент, когда молекулы РНК проходят через резко выраженную зону, отделяющую сахарозу основного градиента от сахарозы градиента образца. При этом полоса образца суживается, и концентрация его градиента возрастает. Этот эффект будет выражен в меньшей степени, если концентрация сахарозы в поверхностном слое основного градиента будет выше концентрации сахарозы в нижнем слое градиента образца пе более чем па 1—2%. Второй фактор, влияющий на градиент концентрации образца, обусловлен присутствием в большинстве градиептов разных по величине РНК. Но мере отделения быстро седимен-тирующих РНК от медленно седиментирующих молекул РНК градиент концентрации образца будет уменьшаться. Суммарное влияние этих двух факторов предугадать очень трудно. Кроме того, при попытке использовать максимальную емкость того или иного градиента нужно отдавать себе отчет в том, что всякое увеличение высоты слоя наносимого образца не может не привести к ухудшению разделения РНК. Поэтому общий накопленный опыт, а также индивидуальные эксперименты помогут устано-пить в каждом конкретном случае те необходимые предельно допустимые количества РНК, которые можно наносить па сахарозный градиент. [c.134]

Сахарозные градиенты монаю фракционировать вручную или автоматически. Первый способ намного дешевле, однако все же автоматическое фракционирование в сочетании с ненрерывной записью поглощения в УФ-свете имеет ряд преимуществ. Прежде всего, при автоматическом фракционировании исключается довольно нудная операция по сбору отдельных фракций и, кроме того, улучшается разделение компонентов (в особых случаях) и сокращается время фракционирования. Тем не менее во многих случаях фракционирование вручную также дает виолие удовлетворительные результаты. [c.134]

Фракционирование вручную. Если сахарозный градиент фракционируют вручную, то центрифужную пробирку закрепляют в специальном устройстве. Мы используем для этой цели резиновую пробку, закрепленную зажимом на штативе. Центрифуншую пробирку осторожно надевают на резиновую пробку так, чтобы эта пробирка оказалась подвешениой. Отверстие в пробке соединяют резиновой трубкой с кусочком стеклянной трубочки, которую можно брать в рот и через нее поддувать воздух, оказывая тем самым давление на раствор градиента в пробирке. [c.134]

Автоматическое фракционирование. Существуют два метода автоматического фракционирования сахарозных градиентов. Согласно первому методу, сбор фракций со дна пробирки осуществляют так, как это было описано для фракционирования вручную. При фракционировании другим методом фракции отбирают сверху пробирки. Для этого на дно пробирки накачивают раствор сахарозы с большей плотностью, так что при этом весь градиепт вытесняется наверх и попадает в прибор, регистрирующий поглощение протекающего раствора в УФ-свете. [c.135]

На фиг. 2 приведен пример успешного разделения в сахарозном градиенте рибосомных РНК, выделенных из клеток млекопитаюнцих. Фракционирование градиента осугцествляли вручную. Если число фракций не слишком мало, то на графике их следует обозначать точками (а не столбиками), которые соеди-гяют между собой линиями, как это показано на фиг. 2. Для того чтобы две РНК хорошо отделить друг Ьт друга, необходимо разделить весь градиент по крайней мере на 25 фракций. На графике необходимо отметить ноложение дна и верха пробирки. Но-видимому, этим не следует пренебрегать, по- [c.136]

Мартин и Амес [12] показали, что скорость двин ения нескольких белков через градиент сахарозы линейно зависит от времени. Это позволяет определить константу седиментации неизвестного веш ества, центрифугируя его в сахарозном градиенте в присутствии сходного с ним веш ества, для которого константа седиментации известна. Для расчета пользуются уравнением [c.136]

Рис. 13.2. Эксперимент, подтверждающий модель, согласно которой часть новообразованной ДНК Е. соН состоит из небольщих одноцепочечных фрагментов, которые в дальнейшем включаются в состав протяженных цепей. Черная кривая отражает распределение по размерам одноцепочечных фрагментов ДНК, наблюдаемое при пульсрвом введении метки и последующем центрифугировании в сахарозном градиенте плотности при pH 12 для предотвращения образования водородных связей между комплементарными цепя-

Справочник химика 21

Химия и химическая технология