Методы фракционирования нуклеиновых кислот

Сравнительно недавно разработан метод электрофореза на полиакриламидном геле. Метод характеризуется высокой разрешающей способностью и применяется для фракционирования и определения размеров, конфигурации и суммарного заряда молекул (белков, нуклеиновых кислот и др.) см. обзор 24]. [c.399]

Распределительную хроматографию на бумаге используют в качестве быстрого стандартного метода анализа нуклеиновых кислот. Ионообменная хроматография на колонках (см. стр. 446) нашла применение прежде всего для препаративного выделения мононуклеотидов и высокомолекулярных продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот. Опыты по фракционированию на крахмале [26, 31] или на адсорбенте [55, 56] не привлекли достаточного внимания. [c.442]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих < оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

Фракционирование методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) основано на применении принципа молекулярного сита, т. е. разделение молекул происходит только по размерам и не зависит от химической природы компонентов. Это свойство отличает метод ГПХ от всех других методов, основанных на растворимости полимеров. Возможность разделения только по размерам особенно важна для сополимеров и полимерных веществ биологического происхождения (белков, нуклеиновых кислот и др.). [c.96]

III. МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.171]

Среди множества методов фракционирования нуклеиновых кислот отметим здесь электрофорез в гелях, высокая разрешающая способность которого позволяет получить любую ДНК или РНК в индивидуальном состоянии. [c.10]

Для иллюстрации изложенных в предыдущем разделе обш их соображений и возможностей использования различных аффинных сорбентов рассмотрим определенное число примеров, отобранных из периодической научной литературы последних трех лет. Большая их часть относится к очистке ферментов клеточного метаболизма (и отдельно — белков, регулирующ,их активность нуклеиновых кислот). Далее будут приведены примеры аффинного фракционирования и очистки самих нуклеиновых кислот, в том числе на иммуносорбентах. Основное внимание уделим более простому и универсальному методу — неспецифической элюции, однако био-снецифическая аффинная элюция белков тоже будет представлена несколькими типичными примерами. Рассмотрение начнем с использования сорбентов с индивидуальной специфичностью, ограничившись здесь тремя примерами, поскольку нет смысла пытаться сколько-нибудь полно иллюстрировать бесчисленное разнообразие возможных сорбентов этого типа. Аффинная хроматография белков клеточного метаболизма на сорбентах с групповой специфичностью будет иллюстрирована подробнее, а затем последуют два примера использования ковалентной хроматографии. [c.412]

Дополнительные рекомендации н методам выделения и фракционирования нуклеиновых кислот [c.69]

Данные таблицы показывают, что для отчетливого выявления изменений в ДНК и РНК тотчас после облучения большое значение имеет не только фракционирование нуклеиновых кислот, но и метод их выделения. Мы применяли метод фракционированного осаждения нуклеиновых кислот спиртом в присутствии ацетата Mg . Деполимеризация ДНК и РНК тотчас после облучения костного мозга выявляется только в том случае, если ДНК и РНК выделяли без применения додецилсульфата натрия. До- [c.48]

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Методы электрофоретического разделения в полиакриламидном и агарозополиакриламидном гелях широко используются в настоящее время для фракционирования нуклеиновых кислот. Преимуществом этих методов является их простота и возможность контролировать ве-нДичину пор геля. При наличии маркёров с известной молекулярной массой или коэффициентом седиментации очи могут быть использованы для характеристики относительной молекулярной массы выделенных препаратов нуклеиновых кислот. [c.173]

В литературе описаны попытки использования сефадексов и биогелей, представляющих собой соответственно сшитый декстран и гранулированный полиакриламидный гель, для разделения компонентов нуклеиновых кислот за счет различного сродства их молекул к сорбенту [32, 33]. Однако в основном гель-хроматографию применяют для фракционирования нуклеиновых кислот и их компонентов в соответствии с размерами молекул этих соединений. Например, на колонке с сефадексом 0-10 нуклеозиды и нуклеотиды отделяются от неорганических солей (выходят со свободным объемом колонки) [34]. Аналогичным образом олигонуклеотиды, содержащие больше 10—15 нуклеотидных остатков, не задерживаются на сефадексе 0-25 или 0-50, а мононуклеотиды проникают в поры геля и поэтому элюируются значительно медленнее [3]. Именно этот метод широко используют для удаления избытка нуклеозидтрифосфатов из смеси биосинтетических олиго- и полинуклеотидов [35]. [c.167]

Многократное повторение актов адсорбции и десорбции при течении раствора через слой адсорбента приводит к отставанию наиболее поверхностно-активных компонентов, что позволяет определить их содержание в исходном растворе или отделить их от других, менее адсорбционно-активных веществ. Методы адсорбционной хроматографии широко применяются для фракционирования аминокислот, нуклеиновых кислот, белков и других биополимеров, для выделения различных ферментов и лекарственных препаратов (пенициллина, тетрациклина, алкалоидов и др.). [c.93]

Способность кизельгура прочно сорбировать белки была использована В. С. Шапотом п сотрудниками, предложившими изящный метод фракционирования нуклеиновых кислот, входящих в состав клеточных нуклеонротеидов. Клетки гепатомы Зайделя, пометив предварительно в них РНК С- или Ш-уридином, а ДНК — Ш-ти-мпдпном, вскрывали детергентом, а гомогенат вносили на колонку, [c.245]

Одним из самых простых и широко распространенных методов фракционирования нуклеиновых кислот и других макромолекул является центрифугирование в сахарозном градиенте. Раствор с градиентом копцентрации сахарозы служит одновременно песуш,ей и стабилизуруюш ей средой, через которую движутся макромолекулы под действием центробежной силы. 1)лагодаря наличию непрерывного градиента концентрации сахарозы возможность перемешивания компонентов при встряхивании и других механических воздействиях сводится к минимуму. Этому способствует также и довольно высокая вязкость растворов сахарозы. Поэтому прп центрифугировании в сахарозном градиепте можно добиться значительно лучшего разделения смеси, чем при центрифугировании в обычном буфере. [c.127]

Методы, собранные в этих двух книгах, весьма разнообразны и охватывают почти все стороны исследований этой важнейшей грунны соединений. Здесь можно найти методы выделения и анализа отдельных компонентов нуклеиновых кислот (пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов), методы выделения, разделения и анализа олигонуклеотидов, изолирования отдельных клеточных органелл, выделения и фракционирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а также изолирования их суммарной фракции для различного рода исследований, способы идентификации нуклеиновых кислот, методу. модификации их молекул, методы изучения их синтеза как in vivo, так и in vitro, методы изучения нуклеиновых кислот в связи с процессом биосинтеза белка и, наконец, методы изучения биологических свойств нуклеи1говых кислот, в том числе их иммунологических свойств. [c.5]

Среди других перспективных методов фракционирования нуклеиновых кислот заслуживают внимания методы хроматографии на белковых адсорбентах (4] к на бензоиди-рованной-наф той лированной ДЭАЭ-целлюлозе [721]. [c.185]

Читателю, специализирующемуся в области биохимии белков и нуклеиновых кислот, можно рекомендовать статью Гинодмана Хроматография белков иа ионообмен-ииках и фракционирование смесей, содержащих белки, на колонках с сефадексом в сб. Современные методы в биохимии , под ред. Ореховича В. Н., I, изд-во Медицина , М., 1964. В этой статье весьма подробно и полно рассмотрены практические приемы работы с колонками, заполненными различными гелями, а также некоторые теоретические положения гель-проникающей хроматографии. Данные, полученные при фракционировании дезоксирибонуклеиновых кислот на колонках с гелями, приводит в гл. Выделение и фракционирование нуклеиновых кислот Кирби в сб. Нуклеиновые кислоты , под ред. Збарского И. Б., изд-во Мир , М., 1966. В этом же сборнике Штэелин в гп. Хроматография олигонуклеотидов и полинуклеотидов на колонках обсуждает результаты фракционирования указанных соединений на колонках с ДЭЛЭ-целлюлозой и другими замещенными целлюлозными аниопообменииками, сефадексом и метилированным альбумином.— Прим. перев. [c.110]

Хороших способов препаративного разделения смесей различных молекул ДНК и РНК пока не существует. Да и получать эти вещества в нативном состоянии, не повреждая их, научились лишь в самые последние годы. При выделении нуклеиновых кислот имеется целый ряд технических препятствий. Самое бо.льшое препятствие — это ферменты рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза, расщепляющие их с огромной скоростью и трудно поддающиеся инактивации. Второе осложнение — чрезвычайная чувствительность макромолекул этих полимеров к гидродинамическим возмущениям. Как указывалось вьппе, достаточно иногда струи, возникающей при быстром выдувании раствора ДНК из пипетки, чтобы вызвать заметную деполимеризацию. Поэтому некоторые из применявшихся до сих пор методов разделения нуклеиновых кислот, дававших пестрые и неясные результаты, были скорее методами разделения частично фрагментированных молекул друг от друга. Это относится, например, к хроматографии препаратов ДНК на колонках с целлюлозным сорбентом EGTEOLA или с глиноземом, покрытым гистоном. Тот факт, что фракционирование ДНК с трансформирующей активностью дало ряд активных фракций, показывает, что здесь имело место не разделение различных молекул ДНК (нет сомнений, что трансформирующая активность по определенному локусу присуща одному типу молекул ДНК), а разделение фрагментов молекул, несущих локус с данной трансформирующей активностью (этот локус может занимать всего 0,1 длины молекулы). То обстоятельство, что при хроматографии осколки разного молекулярного веса будут основательно делиться, не вызывает удивления. Однако это не решает методической задачи фракционирования ДНК на химически индивидуальные вещества. [c.257]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот с успехом применяются крахмальные, агаровые, агарозные и полиакриламидные гели, а также полиакриламидные гели, содержащие агарозу. По электрофорезу РНК [105] и ДНК [387] в крахмальном геле имеется сравнительно мало работ. Электрофорез в других поддерживающих средах дает более высокое разрешение. Ричардс и Леканиду [1086] пришли к заключению, что методом электрофореза в полиакриламидном геле можно разделить смесь полинуклеотидов, имеющих мол. массу менее 10 000 и различающихся по длине всего на один нуклеотидный остаток. Рубину [1117] удалось разделить 4S-, 5S- и 5.8S-PHK. Филлипс и Тимко [1004] описали разделение 5S-PHK на два компонента. Определяя степень разрешения, которую можно достигнуть при электрофоретическом разделении РНК, они сделали вывод, что для молекул РНК, имеющих константы седиментации между 22 и 45S, степень разрешения составляет две единицы S в случае двух параллельных проб ошибка определения будет равна 5%. При шести повторных определениях степень разрешения составляет одну единицу S даже для более мелких молекул. Эти примеры свидетельствуют о том, что методы электрофореза в гелях дают превосходное разрешение при фракционировании нуклеиновых кислот. [c.369]

Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе — это наиболее удобный метод анализа как ДНК так и РНК. В данной главе изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно обработанной рестриктазами. Метод основан на том, что скорость миграции линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине. Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины, а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать зоны, содержащие всего [c.280]

Уже упоминалось, что высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком дав.лении (ЖХВД) по.лучила очень широкое распространение главным образом в качестве экспресс-метода технологического контроля производства низкомолекулярпых природных (и неприродных) соединений. В исследованиях белков и нуклеиновых кислот ЖХВД играет пока бо.лее скромную, но заметную роль (фракционирование пептидов, идентификация аминокислот прц секвеннровании белков и др.). Далее мы увидим, что для исследо- [c.91]

Спехтрофотомгтричесхие методы применимы в тех случаях, когда детектируемые вещества обладают характерным спектром поглощения в видимой или ультрафиолетовой области. В табл. 7.2 приведшы характерные максимумы поглощения для компонентов нуклеиновых кислот (максимальные поглощения для компонентов ДНК и РНК близки), для аминокислот, поглощающих в Сидней УФ-области спектра, и некоторых упоминавшихся в тексте низкомолекулярных соединений. Приведенные значения молярных экстинкций для аминокислот и нуклеотидов дают представление о порядке величин молярных экстинкций биополимеров, поскольку эти значения варьируют в составе биополимеров в не очень широких пределах. При применении спектрофотом ического метода Дйи детекции биополимеров по ходу фракционирования следует иметь в виду, что в используемых водных растворах практически всегда присутствуют различные низкомолекулярные соединения, в первую очередь вспомогательные электролиты, вводимые для создания н жных значений pH и ионной силы. Эти соединения должны быть прозрачны в области поглощения, используемой для деггасции выделяемых биополимеров, тем более что концентрация вспомогательных веществ нередко на несколько порядков превышает концентрацию биополимеров. [c.248]

При очистке ДНК и РНК в основном используются одни и те же приемы [62]. Различия в методах их фракционирования определяются значительно большей чувствительностью молекул РНК к гидролитическому расщеплению из-за присутствия у ри-бонуклеотидов, входящих в состав РНК, свободных 2 -ОН групп, их более низкой молекулярной массой и наличием у одноцепочечных молекул характерной (компактной) пространственной структуры. Все современные методы выделения нуклеиновых кислот состоят из трех этапов разрушения клеток, инактивации нуклеаз и собственно очистки. Для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии необходимо соблюдать, по крайней мере, две предосторожности следует использовать мягкие условия разрушения тканей биологического объекта и инактивировать гидролитические ферменты (ДНКазы или РНКазы) до того, как [c.40]

Фракционирование нуклеиновых кислот. В 1965 г. Ричардс с сотр. [686] предложили метод электрофореза в но лдакриламидном теле для фракционирования клеточных рибонуклеиновых кислот, а затем Бишоп с сотр. [204 использовали этот метод для фракционирования вирусных нуклеиновых кислот. [c.187]

Последние годы ознаменовались огромными успехами в изучении строения и функций важнейших биологически активных полимеров. Благодаря развитию новых методов разделения н очистки веществ (различные методы хроматографии, электрофореза, фракционирования с использованием молекулярных сит) и дальнейшему развитию методов рентгеноструктурного анализа и других физико-химических методов исследования органических соединений стало возможным определение строения сложнейших природных высокомолекулярных соединений. Изучено строение ряда белков (работы Фишера, Сейджера, Стейна и Мура). Установлен принцип строения нуклеиновых кислот (работы Левина, Тодда, Чаргаффа, Дотти, Уотсона, Крика, Белозерского) и экспериментально доказана их определяющая роль в синтезе белка и передаче наследственных признаков организма. Определена последовательность нуклеотидов для нескольких рибонуклеиновых кислот. Широкое развитие получили работы по изучению строения смешанных биополимеров, содержащих одновременно полисахаридную и белковую или липидную части и выполняющих очень ответственные функции в организме. [c.53]

В середине 1960-х годов начались исследования нуклеотидных последовательностей РНК. Первыми были определены первичные структуры тРНК (Р. Холли и сотр., 1965 А. А. Баев и сотр., 1967). Развитие техники фракционирования фрагментов нуклеиновых кислот и прежде всего гель-электрофореза (Ф. Сэнгер и сотр.) позволило в начале 1970-х годов приступить к изучению первичной структуры высокомолекулярных РНК. В 1976—1978 гг. были созданы исключительно быстрые и эффективные методы секвени-рования ДНК и РНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сэнгер и сотр.), которые позволили за короткое время получить огромную информацию о первичной структуре генов, их регуляторных элементах, вирусных и рибосомных РНК и т. д. [c.7]

Очевидно, что многие нуклеозиды являются интермедиатами в биосинтезе н расщеплении нуклеотидов и полинуклеотидов. В дополнение к так называемым спонгонуклеозидам (термин, применяемый к модифицированным пуриновым нуклеозидам, полученным из карибской губки ryptotethya rypta), которые являются производными арабинозы, многие антибиотики являются производными нуклеозидов, часто имеющих модифицированные углеводные остатки они будут детально обсуждаться позднее. Нуклеозиды сравнительно легко выделить из химических или ферментативных гидролизатов природных полинуклеотидов условия и практические детали этого процесса можно найти в общих учебниках по нуклеиновым кислотам [2, 7, 24]. Все коммерчески доступные образцы основных нуклеозидов получены этим путем. Для выделения больщих количеств таких нуклеозидов наиболее целесообразно применение относительно грубого фракционирования, основанного на различной растворимости, и методов ионного обмена. Для выделения малых количеств модифицированных нуклеозидов либо из природного источника, либо полученных в результате химического синтеза, пригодны многочисленные более эффективные методы, и они будут обсуждаться отдельно. Наконец, следует помнить, что выделение нуклеозидов часто осуществляют дефосфорилированием нуклеотидов [25], выделение и разделение которых не будет рассматриваться в настоящей главе. [c.72]

Подробный анализ процесса хроматографии нуклеиновых кислот и их продуктов гидролиза на ионообменнике был опубликован Коном [14, 22, 23], а также Собером и Петерсоном [81]. Рандерат впервые описал фракционирование низкомолекулярных осколков нуклеиновых кислот (нуклеиновых оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов) на эктеола [68, 69, 73] и на слоях ДЭАЭ [72, 73]. Он установил, что нуклеотиды можно разделить методом ионообменной ХТС значительно быстрее и лучше, чем при использовании других методов кроме того, метод ХТС значительно чувствительнее метода хроматографии на бумаге. [c.447]

Тонкослойная хроматография (ТСХ английское TL ) и предшествовавший ей метод хродгатографии на бумаге до середины 70-х годов занимали центральное место в исследованиях структуры белков и нуклеиновых кислот. В последнее десятилетие эти методы были явно оттеснены электрофорезом и высокоэффективной жидкостной колоночной хроматографией при высоком давлении. Оба метода превосходят ТСХ но разрешающей способности, а второй из них — и по скорости анализа. Кроме того, в результате ЖХВД экспериментатор получает уже разделенные жидкие фракции исходного препарата, в то время как после ТСХ ему надо еш,е локализовать пятна на пластинке, а в случае необходимости дальнейшего анализа — выполнить длительные операции элюции из них веш,ества. Точное и проводимое в ходе самого фракционирования определение микроколичеств вещества во фракциях прп ЖХВД, которое позволяют осуществить высокочувствительные детекторы и интегрирующие устройства современных жидкостных хроматографов, оставляет далеко позади соответствующие возможности ТСХ — ввиду плохой воспроизводимости процессов элюции из пятен и высокого уровня фона или самопоглощения в слое носителя при использовании оптических, флюоресцентных и радиоактивных методов оценки количества вещества в пятнах на пластинке без его элюции. Наконец, в препаративном варианте фракционирования количественные возможности ТСХ на несколько порядков меньше, чем у обычной колоночной хроматографии и даже у электрофореза. [c.457]

Что касается самого процесса ТСХ, то здесь можно усмотреть далеко идущую аналогию с жидкостной хроматографией на колонках. Неподвижную фазу образует н идкость, связанная со слоем фиксированного на подложке гранулированного сорбента, свойства и характеристики которого близки, а иногда даже идентичны таковым для материалов, используемых в качестве носителей неподвижной фазы в колоночной хроматографии. Здесь используются те же производные целлюлозы или силикагеля, к которым надо добавить только полоски ацетилцеллюлозы. Подвижную фазу образует жидкий элюент с аналогичными, рассмотренным ранее свойствами. Неизменной остается и сущность хроматографического процесса, базирующегося на равновесном распределении вещества между неподвижной и подвижной фазами. Как и в любом хроматографическом процессе (гель-фильтрация в тонком слое была рассмотрена в гл. 4), для целей хроматографического фракционирования это распределение должно быть сильно сдвинуто в пользу неподвижной фазы. Из всех вариантов хроматографпп для разделения компонентов белков и нуклеиновых кислот методом ТСХ (сами биополимеры очень редко выступают здесь в качестве объектов) практически пспользуют только два нормальнофазовую распределительную и ионообменную. [c.458]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология