Полиакриламидные гели элюирование

При более низких или более высоких pH возможен гидролиз нейтральных амидных групп. Не рекомендуется также использовать сильные окислители. Биогели устойчивы во всех обычных растворителях, применяемых для элюирования. Частицы полиакриламидного геля сильно прилипают к чистой поверхности стекла, и поэтому рекомендуется [46] силанизировать поверхность стекла или вести работу в полиэтиленовых сосудах. [c.24]

Препаративный ИТФ в полиакриламидном геле можно выполнять на приборе для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле. В связи со значительным увеличением объема полиакриламидного геля во время прохождения зон, поверхность геля становится выпуклой, если гель прилипает к стенкам прибора. По этой причине прибор, изготовленный из плексигласа, к которому полиакриламидный гель не прилипает, лучше, чем стеклянный прибор. Экспериментальные условия следующие площадь сечения геля 5,3 см , длина трубки 20 см, толщина стенки 0,2 см, скорость элюирования 28 мл/ч, стабилизованный ток 10 мА, температура охлаждающей воды 10 °С. [c.348]

Определение молекулярных масс белков возможно также с помощью колоночной гель-проникающей хроматографии на полисахаридных или полиакриламидных гелях с поперечными сшивками (разд. 5.6.3.4). Этот метод, названный гель-фильтрацией, позволяет производить оценку гомогенности по размерам молекул, а также разделять белки с различными молекулярными массами. Зная объем элюирования изучаемого белка, можно оценить его величину, если колонка предварительно прокалибрована по белкам с известными молекулярными массами. [c.133]

Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе осуществляют с помощью ступенчатого элюирования, подавая на колонку последовательно следующие растворы 0,02 М натрий-ацетатный буфер, pH 4,6 ( стартовый буфер), затем 0,05 М натрий-ацетатный буфер, pH 5,2 0,08 М натрий-ацетатный буфер, pH 6,0 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,0 и, наконец, 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 0,5 М Na l, pH 8,3. Каждый новый раствор подают на колонку только после того, как полностью элюируется пик, вымываемый предыдущим раствором. Скорость тока приблизительно составляет 50 мл/ч. Элюат собирают порциями по 2—3 мл. Обработку результатов см. на с. 108. Идентификацию белков осуществляют методом электрофореза на бумаге или в полиакриламидном геле (с. 112). Регенерацию КМ-целлюлозы проводят вне колонки. [c.113]

Идеальная матрица должна работать только по принципу молекулярного сита. Сшитые декстраны и полиакриламидные гели нельзя считать идеальными матрицами, и это необходимо учитывать при проведении эксперимента. Во-первых, эти материалы сильно сорбируют пептиды, содержащие остатки ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина). При элюировании буферными растворами, содержащими вещества ароматической природы, мочевину или роданид калия, адсорбция несколько снижается, однако полностью не исчезает. Известно также, что адсорбция на сефадексе несколько возрастает при увеличении ионной силы [19], однако удовлетворительного объяснения этому явлению не дано. Во-вторых, матрица содержит небольшое количество карбоксильных групп. Вследствие этого независимо от молекулярного веса пептидов может наблюдаться ускорение компонентов, несущих отрицательный заряд, и удерживание или необратимая адсорбция основных пептидов. Этот эффект подавляется в том случае, если ионная сила буферного раствора превышает 0,02. [c.396]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Постоянную скорость элюирования задают с помощью перистальтического насоса. Элюат, собираемый на фракционном коллекторе, анализируют в потоке или выборочно по фракциям на содержание белка, для чего обычно регистрируют изменение оптической плотности при 280 нм. Другие методы детектирования используют при отсутствии в белке хромофоров (остатков триптофана и тирозина), при работе иа микроуровне или при слишком высоком поглощении при 280 нм, например благодаря присутствию кофактора. В этих случаях можно определять оптическую плотность при 220 им, интенсивность флуоресценции или радиоактивность (при работе с мечеными белками) [14, 161] наконец, при анализе белковых фракций можно использовать химическую модификацию (разд. 1.4.5.1). Например, определенные объемы (аликвотные части) отдельных фракций можно подвергнуть щелочному гидролизу и последующему анализу по реакции с нингидрином. Для обнаружения белков можно использовать реакцию Лоури или реакцию связывания кра-снтеля. Последний метод вполне можно рекомендовать как наиболее простой и чувствительный, причем этому определению не мешает присутствие химических реагентов. Кроме того, состав фракций можно определять с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.23]

При хроматографии полисахаридов и высших олигосахаридов предпочтительным является использование элюентов с высокой ионной силой для предотвращения ассоциации молекул хроматографируемых веществ и их взаимодействия с сорбентом. Данный прием приобретает особое значение в анализе молекулярно-массового распределения, при проведении которого рекомендуется в качестве элюента 0,3%-ный [124] или 0,9%-ный раствор Na I [125]. Однако наиболее широкое применение для этой цели находит 1М Na I [132, 170—173], использование которого для элюирования колонок с полиакриламидными и агарозными гелями обычно обеспечивает достаточную воспроизводимость хро.матографических данных. Полученные таким образом результаты можно использовать при анализе олигосахаридов, образующихся при избирательном расщеплении изучаемых полисахаридов [171—173]. [c.33]