Иммуноаффинная хроматография антител

Рис. 6.8. Очистка химерного белка с помощью иммуноаффинной хроматографии. Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки.

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

В зависимости от области применения антител и от их свойств можно использовать самые различные способы очистки. Для диагностических целей часто достаточно имет препараты антител 70-95%-ной степени чистоты. С другой стороны, при применении антител in vivo их чистота должна быть намного выше. В сывороточных средах содержание антител не превышает 10% от общего количества белка. Хотя проведение процесса на бессывороточных средах и облегчает очистку, на практике относительно легко достичь 90%-ной и даже более высокой степени чистоты независимо от содержания сывороточных белков. При очистке антител для их использования ш vivo на последних стадиях очистки приходится решать одни и те же проблемы независимо от природ и питательной среды. Высокоэффективные методы очистки необходимы для удаления следовых количеств не только примесных белков, но и пирогенов и ДНК. Ранее для очистки антител широко применяли фракционирование сульфатом аммония с послед)пющей ионообменной хроматографией. Применение этих методов осложняется тем, что различные моноклональные антитела имеют разные изо-электрические точки [34, 36 J. Кроме того, после ионообменной хроматографии чистота антител не превышает 90%, поэтому для дальнейшей очистки необходимы другие методы, например гель-фильтрация. Однако в тех случаях, когда моноклональные антитела использ)пют для диагностики или иммуноаффинной очистки, ионообменная хроматография или ее сочетание с предварительным осаждением позволяют получить препараты достаточного качества. [c.47]

Гомогенность и специфичность центров связывания моноклональных антител делают их особенно удобными для использования в иммуноаффинной хроматографии. В табл. 6.15 мы приводим высокоэффективный метод получения иммуносорбентов для колонок и их применения, а также различные варианты условий элюции, которые позволили нам очень эффективно с сохранением их биохимической активности очистить макромолекулы, обладающие высокой чувствительностью к воздействию оазличпых агентов и находящиеся в низкой концентрации. [c.196]

В том случае, когда количество исследуемого антигена достаточно только для первоначальной иммунизации, используют другой вариант иммуноаффинной хроматографии, разработанный сравнительно недавно. Полученные антитела иммобилизуют на нерастворимом носителе и экстракт, содержащий антиген, наносят на колонку. Десорбцию осуществляют обычным способом. Однако при приготовлении сорбента, сорбции и элюировании необходимо иметь в виду высокую лабильность антител в присутствии денатурирующих агентов. [c.188]

GGT из почек крысы. Для очистки легкой формы GGT из. почек крысы можно воспользоваться описанной выше методикой для проведения иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных антителах против GGT из почек крысы. Фермент, элюированный водой, обладает в 330 раз большей активностью, чем исходный гомогенат при суммарном выходе 46%. Данные по очистке суммированы в табл. 6. [c.159]

Необратимость взаимодействия клеток с аффинным носителем хотя адсорбция клеток на специфических иммобилизованных лигандах зачастую достигается легко, постоянно возникали трудности при последующем выделении связавшихся клеток с применением методов, совместимых с жизнеспособностью клеток. Одна из причин этих трудностей — многоточечное связывание между клеткой и носителем каждая клетка обладает многочисленными рецепторами для иммобилизованного лиганда, причем несколько молекул лиганда сами связаны с одной и той же частицей матрицы или поверхности. Второй причиной необратимого связывания клеток с аффинным носителем может быть очень высокое сродство между иммобилизованным лигандом и его рецептором на поверхности клетки, которое часто возникает, если узнавание клетки и лиганда основано на взаимодействии антиген — антитело это весьма серьезное ограничение при выделении жизнеспособных клеток иммуноаффинной хроматографией. [c.247]

Многие интерфероны были в последнее время успешно очищены. Наиболее эффективные этапы очистки включают хроматографию на голубой сефарозе и веществах, хелатирующих Си и Zn [21, 127], адсорбционную хроматографию на пористом стекле [116, 267, 279] и иммуноаффинную хроматографию с использованием как поликлональных, так и моноклональных антител [30, 170]. Процедуры очистки с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН позволяют одновременно получать интерфероны разных классов [99]. [c.54]

Иммуноаффинная хроматография (Immunoafflnity hromatography) Метод очистки, при котором фиксированное на матрице антитело связывает специфичесыш белок, присутствующий в сложной смеси других белков. [c.549]

Как это детально показано в разд. 6.3, антитела проявляют высокое сродство соответствующим антигенам и наоборот. Трудности их освобождения из комплексов 0бусл0 Влены именно этим сильным взаимодействием. Использования сильных хаотропных элюентов в иммуноаффинной хроматографии можно избежать путем химической модификации иммобилизованных аффинных лигандов [39]. Например, элюирование антиглюкагоновых антител из колонки с иммобилизованным глюкагоном может быть осуществлено в мягких условиях, если частично нарушить пространственную комплементарность к связывающему участку антитела путем избирательной модификации гормона, например реакцией с 2-окси-5-нитробензилбромидом, тетранитрометаном или перекисью водорода. [c.107]

Эффективность аффинной хроматофафии зависит преимущественно от выбора лиганда или акцептора, который определяет природу вьщеляемого мембранного белка. Существенным фактором в этом случае является сродство лиганда к рецептору, и поэтому самыми эффективными лигандами оказываются специфические блокаторы или антагонисты нейрорецепторных белков. Иногда для вьщеления конкретного белка используют две или три ступени аффинной хроматофафии на разных сорбентах и с разньаш лигандами. Получили широкое распространение методы иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лиганда используется поликлональные или моноклональные антитела, полученные к компонентам рецептора. [c.268]

При анализе методом двойной иммунодиффузии препарат GGT, очищенный из почек быка с применением иммуноаффинной хроматографии, дает с гомологичными антителами три отдельные дуги преципитации, каждая из которых проявляет GGT-активность. Ферментный препарат может быть также разделен на четыре активные фракции изоэлектрическим фокусированием. GGT из почек крысы, очищенная на иммуноадсорбенте, дает с гомологичными антителами две дуги преципитации, обладающие ферментативной активностью. Эти наблюдения подтверждают предположение, что GGT присутствует в виде нескольких молекулярных форм, которые могут отличаться по содержанию сиаловой кислоты. Тэйт и Мейстер [34] впервые продемонстрировали, что чистая легкая форма GGT из почек крысы может быть разделена на несколько ферментных форм. Эти наблюдения делают очевидным тот факт, что молекулярные формы, очищенные на иммуноадсорбентах, иммунологически неразличимы. [c.162]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология