Эукариотические белки

Эукариотические белки-регуляторы могут включаться и выключаться [18] [c.197]

Рис. 4,8. Основные этапы выделения активных, растворимых эукариотических белков из нерастворимых включений клеток.

Все данные свидетельствуют о том, что эффект сАМР на эукариотические белки опосредован фосфо- [c.164]

Экспрессия эукариотических генов в бактериальных клетках связана еще с одной проблемой большая часть рекомбинантных эукариотических белков, а также некоторые прокариотические белки при очень высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя в клетках так называемые тельца [c.119]

Имитация посттрансляционных модификаций белков. Посттрансляционные модификации белков являются одним из важнейших этапов экспрессии генов. Большинство эукариотических белков становятся функционально-активными лишь после ковалентного присоединения к их функциональным группам модифицирующих молекул. Кроме того, посттрансляционные модификации, например, фосфорилирование или ацетилирование белковых молекул, являются важным механизмом регуляции их биологической активности. Исследование молекулярных механизмов регуляции активности белков под действием их ковалентных модификаций сдерживается отсутствием адекватных модельных систем. Например, стандартным методом получения специфически фосфорилированных белков является их инкубация с соответствующей протеинкиназой в присутствии субстратов. Однако обычно не удается контролировать уровень фосфорилирования белка, а также специфичность самой реакции. Использование Метода EPL позволяет решить эту проблему путем объединения [c.317]

Синтез нормальных и модифицированных эукариотических белков [c.359]

Г. Аминокислотную последовательность эукариотического белка [c.41]

Ж. Чтобы получить большое количество эукариотического белка [c.41]

Для получения фрагментов ДНК, кодирующих эукариотические белки, на очищенной мРНК как на матрице синтезируют комплементарную цепь [c.78]

Для получения гетерологичных рекомбинантных белков с клонированной эукариотической комплементарной ДНК (кДНК) обычно используются прокариотические системы экспрессии. Однако в некоторых случаях эукариотические белки, синтезированные в бактериях, оказываются нестабильными или биологически неактивными. Кроме того, как бы тщательно ни проводилась очистка, конечный продукт может быть загрязнен токсичными веществами или веществами, вызывающими повышение температуры у человека и животных (пирогенами). Чтобы решить эти проблемы, для получения рекомбинантных белков, предназначенных для использования в медицине, были разработаны эукариотические системы экспрессии. Такие белки должны быть идентичны природным по своим биохимическим, физическим и функциональным свойствам. Неспособность прокариот синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансля-ционных модификаций. [c.135]

В результате мы имеем синтетическую кДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность данного белка. Заметим, однако, что если эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она не идентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т. е. вставочных последовательностей, ни стартовых и терминирующих сигналов, присущих генам большинства эукариотических белков. [c.985]

Во всех случаях существуют ферментные системы, удаляющие ненужные аминокислотные остатки с N-конца. В бактериальных клетках и в митохондриях фор-мильный остаток отщепляется специальным деформили-рующим ферментом. В том случае, если в белке N-концевой аминокислотой является метионин, то достаточно только этой модификации. В случае бактериальных и эукариотических белков, имеющих на N-конце другие аминокислоты, метионин отщепляется с помощью ами-нопептидазы. Когда же возникает необходимость в обеих реакциях, они осуществляются последовательно (рис. 6.3). Реакция (реакции) удаления ненужных аминокислотных остатков происходит довольно быстро-возможно, когда образующаяся полипептидная цепь достигнет в длину 15-30 аминокислот. [c.74]

РНК и белка в них больше, чем в бактериальных рибосомах. Это объясняется следующими причинами молекулы РНК длиннее, и больше белковых молекул ( 82) входит в состав рибосом. Доля РНК в 808-рибосомах меньше, чем в708-рибосомах и составляет 50 и 65% от масс соответственно малой и большой субчастиц (как говорилось в гл. 6, намного сложнее, чем у бактерий, организованы и вспомогательные факторы, принимающие участие в процессах инициации и элонгации). Возможно, большинство, а может быть, и все белки входят в состав эукариотических рибосом в стехеометрических соотношениях, однако точно это не доказано. Сходства между рибосомными белками бактерий и эукариот выявить не удалось, но за одним исключением L7/L12 могут заменить аналогичные эукариотические белки в составе 808-рибосом. [c.104]

Разработанные сравнительно недавно методы работы с рекомбинантными ДНК (обсуждаемые в гл. 9) позволили сравнить нуклеотидные последовательности индивидуальных мРНК, кодирующих некоторые известные эукариотические белки, с соответствующими фрагментами последовательностей в хромосомной ДНК. Благодаря использованию этих методов в 1977 г. было сделано сенсационное открытие. Оказалось, что внутри кодирующих областей некоторых эукариотических генов содержатся нетранслируемые фрагменты последовательности. Так, некодирующие внутренние нуклеотидные последовательности были обнаружены в структурных генах р-цепей кроличьих и мышиных гемоглобинов, легких цепей иммуноглобулинов и куриного овальбуми-на (основного компонента яичного белка). На сегодняшний день ясно, что наличие внутренних некодирующих последовательностей является типичным, хотя и не обязательным свойством эукариотических генов. На карте структурной организации гена овальбумина (рис. 11.17) показано, как семь протяженных внутренних некодирующих участков последовательности (интронов) разделяют смысловую последовательность, кодирующую зрелую мРНК, на восемь фрагментов (экзонов). [c.55]

В тех относительно редких случаях, когда два сильно различающихся эукариотических белка образуются из одной гранскрипционной единицы, говорят, что эти белки кодируются различными генами, которые на хромосоме перекрываются. Однако определение видоизмененных белков, образующихся в результате альтернативного сплайсинга РНК, как продуктов перекрывающихся генов, может показаться излишне усложненным. Проще изменить исходную формулировку и считать геном любую последовательность ДНК, которая транскрибируется как отдельная единица и кодирует набор близкородственных полипептидных цепей (изоформы белков). [c.227]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Имеются два общих подхода к осуществлению внутриклеточной экспрессии клонированных генов. Соответствующий ген может быть клонирован в одной рамке считывания с синтетическими или бактериальными кодирующими последовательностями и экспрессироваться с образованием гибридного белка. Другой способ — непосредственная экспрессия встроенного гена. Потребность в экспрессии эукариотических полипептидов в составе гибридных белков возникла, когда было обнаружено, что уровень экспрессии эукариотических белков в клетках Е. oli ограничивается по той причине, что они распознаются клеткой как чужеродные и разрушаются [9]. Это особенно наглядно проявилось в случае полипептидов небольшого размера. При сшивании эукариотического гена с бактериальным синтезировались гибридные продукты, которые накапливались в клетке в значительно больших количествах [10, 11]. Однако, если требуется получить эукариотический полипептид в чистом виде, возникает необходимость в методе, позволяющем правильно расщепить гибридный белок. С другой стороны, непосредственная экспрессия одного эукариотического гена дает возможность получить нужный белковый продукт. Однако первичные продукты трансляции несут на своем Ы-конце остаток метионина. В клетках Е. соН имеются ферменты, осуществляющие при необходимости эффективное отщепление метионина от природных белков однако в случае рекомбинантных белков эти ферменты работают не столь эффективно [1]. Таким образом, белки, полученные в результате прямой экспрессии эукариотического гена, могут содержать несвойственный природному белку N-концевой метионин. [c.98]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Следует кратко остановиться на процессинге сигнальных пептидов и вирусных полипротеинов. Сигнальная последовательность прокариотических и эукариотических белков организована таким образом, что имеется кластер положи- [c.172]

Заманчивой представляется идея присоединения эукариотического структурного гена сразу за генетическим эквивалентом сигнальной последовательности экзофермента, синтезирующего с высокой эффективностью. В случае процессинга можно ожидать выделения в среду зрелого эукариотического белка в большом количестве. Такая система имеет ряд преимуществ облегчается очистка целевого белка, так как состав секретируемых белков несравненно проще состава внутриклеточных протеинов выделяющийся из клетки белок оказывает значительно меньшее влияние на метаболизм клетки, что облегчает его сверхпродукцию. [c.198]

В чем же причина такого аномального поведения рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основных механизма компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации. Образующиеся в эндоплазмати-ческом ретикулуме полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посттрансляционные модификации. При этом внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных гранулах, pH в которых составляет 4,5-5,5, в то время как pH цитоплазмы бактериальных клеток приближается к 7,8. В этих условиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Белки молока являются интегральной частью мицелл, стабилизированных ионами Са2+. [c.120]

Более универсальным подходом к получению рекомбинантных белков в растворимой форме является обеспечение секрети-руемого характера их экспрессии, т.е. секреции синтезирующихся рекомбинантных белков в питательную среду [148]. Системы секреции у грамположительных и грамотрицательных бактерий интенсивно изучаются. Получение рекомбинантных эукариотических белков в секретируемой форме высокотехнологично, поскольку значительно облегчает их очистку. Кроме того, у секретируемых белков больше шансов приобрести нативную конформацию, так как сворачивание полипептидных цепей происходит в большом объеме, а следовательно, и более низкой их концентрации, что предотвращает агрегацию полипептидных цепей, не полностью сформировавших свою третичную структуру. Примером эффективного использования секреторной системы Е. соН является получение рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) в секретируемой форме [149]. В этой системе удавалось нарабатывать до 1 г рекомбинантного белка в 1 л бактериальной культуры. Секретируемая система экспрессии на основе грамотрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa будет кратко рассмотрена ниже в разделе 5.1.1. [c.122]

Несмотря на определенные успехи в получении нативных рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках, эти системы экспрессии эукариотических генов в настоящее йремя еще далеки от совершенства. По-прежнему остается открытым вопрос о посттрансляционных модификациях рекомби- [c.123]

Однако не всегда при успешной экспрессии чужеродного гена можно получить функционально активный продукт. Дело в том, что многие эукариотические белки активируются только после их модификации (например, после протеолиза, гликозилирования, фосфорилирования и т. п.), происходящей в результате действия специфических клеточных ферментов. Но чужеродные белки могут неправильно модифицироваться или не модифицироваться вообще. Это ограничивает выбор реципиентных клеток, когда нужно получить активные модифицированные белки. В таких случаях для клонирования генов приходится использовать клетки орга низмов, родственных тем, откуда были взяты гены. С этой целью разрабатываются системы клонирования и экспрессии генов в различных семействах бактерий и низших грибов, в растительных и животных клетках ( Транскрипция и трансляция. Методы , 1987 Maximizing gene expression , 1986). [c.314]

Исходно цель опытов с использованием рекомбинантных ДНК состояла в получении важных с медицинской и экономической точек зрения белков, например вакцин и межклеточных пептидных посредников (инсулина, гормона роста и оксигоцина). Идея заключалась в клонировании гена, кодирующего данный полипептид, встраивании его в плазмиду, которая реплицируется в Е. соИ таким образом, чтобы промотор Е. соИ регулировал транскрипцию, а затем в синтезе на рибосомах Е. соИ больших количеств нужного белка. Почему эта довольно прямолинейная схема оказалась сложнее, чем вначале предполагалось (разд. 7.8) Во-первых, в большинстве эукариотических генов имеются интроны, а в генах Е. соИ их нет у бактерий отсутствует механизм сплайсинга, и поэтому невозможно получить соответствующую данному эукариотическому гену мРНК. Во-вторых, из первичных продуктов трансляции многих эукариотических генов, в частности из предшественников полипептидных гормонов, может образоваться активный генный продукт лишь в результате специфического посттрансляционного процессинга, который в клетках Е. соИ не осуществляется. Наконец, успешному получению больших количеств многих эукариотических белков мешает их токсичность для бактериальных клеток, деградация бактериальными протеазами и нерастворимость в цитоплазме бактериальной клетки. [c.359]

Более просто организованная система секреции белков через плазматическую мембрану вполне может быть смоделирована в эксперименте. Данный подход представляет значительный интерес для биотехнологии, так как заманчиво методами генетической инженерии создавать гибридные гены, которые обусловливали бы секрецию чужеродньк белков из цитоплазмы клетки. Большинство эукариотических белков, синтезируемых в генно-инженерно сконструированных штаммах Е. соИ, сохраняют N-koh-цевой метионин и тем самым отличаются от природных форм этих белков. Преодолеть данное затруднение можно, состыковав кодирующие последовательности зрелой формы изучаемого белка и какого-либо сигнального пептида Е. oli. При правильном процессинге синтезируемого химерного белка в Е. соИ будет образовываться полноценный эукариотический полипептид. Более того, секреция может защитить чужеродный белок от многочисленных протеаз цитоплазмы клетки и за счет этого повысить уровень его синтеза штаммом-продуцентом. [c.132]

К. Тэлмэйдж и В. Гилберт в 1982 г предложили новый подход к стабилизации чужеродных белков в клетках Е. соИ путем создания гибридного гена, белковый продукт которого способен секретироваться в периплазму Е. oli (см. 2.2.10), где он защищен от действия многочисленных протеаз цитоплазмы клетки. На примере ряда эукариотических белков показано, что таким образом удается существенно повысить выход целевого белка. [c.154]

Подобную систему предложили К. Нагаи и X. Тоджерсен (1984 г.), но вместо коллагеназо-специфичной последовательности они использовали тетрапептид Ile-Glu-Gly-Arg, специфично узнаваемый фактором коагуляции крови Ха. Фактор Ха узнает эту последовательность в составе тройного химерного белка и расщепляет его только по остатку аргинина. В результате можно достаточно просто и с высокой эффективностью получать индивидуальный эукариотический белок, соответствующий по всем свойствам природному прототипу (в частности, он не имеет N-концевого метионина). Данный тетрапептид редко встречается в последовательностях белков, и поэтому разработанная система экспрессии-выщепления может быть использована для эффективной продукции в клетках Е. oli многих эукариотических белков. [c.162]