Работа с клонированными генами

Большой интерес для генетической инженерии представляет достижение правильной экспрессии клонированной генетической информации в клетках-реципиентах. Экспрессию легко выявить, если клонируемый ген при правильной транскрипции и трансляции обеспечивает функциональную комплементацию мутаций генома клетки. В этом случае нужный гибрид может быть обнаружен простым отбором трансформированных клонов на селективной среде. Например, в одной из первых работ такого типа, выполненной в 1976 г в лаборатории Р. Дэвиса, выяснилось, что гибридная ДНК, полученная при встройке определенных фрагментов хромосомной ДНК дрожжей-сахаромицетов в ДНК векторного фага Я, комплементирует мутацию Е. соН hisB. Клоны, содержащие такие гибриды, отбирали по способности клеток расти на питательной среде без гистидина. В дальнейшем данный подход неоднократно использовался при попытке клонировать чужеродные гены. [c.35]

Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать их организацию (блоттинг-гибридизация по Саузерну), строение мРНК (нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например, в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-гибридизации выделенной РНК (разд., 6.3). Более подробные качественные исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]). 5 - и З -концы транскриптов определяют, используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют установить только строение транскрибируемой области или гена, а также механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции. При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями, уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей, расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором расстоянии от 5 - и З -концов транскрибируемого-гена. Используя разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК, удается, модифгщировать клонированные гены и затем после введения мутантного гена-путем генетической трансформации обратно в растения анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные методики способствовали изучению нуклеотидных [c.307]

TAR-клонирование способно сушественно ускорить выполнение программы Геном человека . Напомним, что анализ геномов начинается с создания банков генов отдельных хромосом, выделение которых является очень трудоемкой задачей. Оказалось, что с помощью TAR-векторов можно селективно клонировать ДНК человека из суммарной ДНК межвидовых гибридов соматических клеток (см. гл. 5). содержащих одну человеческую хромосому. Эта процедура позволяет обогащать человеческую ДНК в 3000 раз. Более того, на примере гена BR A2, мутации в котором с высокой вероятностью приводят к появлению рака молочной железы, была продемонстрирована эффективность TAR-клонирования и для выделения специфических последовательностей из геномной ДНК человека (Larionov et al., 1997) С этой целью был сконструирован кольцевой TAR вектор, который при линеаризации содержал на одном конце промотор гена BR A2, а на другом — его дистальную часть. Стандартные операции кольцевого TAR-клонирования позволили за неделю работы впервые изолировать этот ген из геномной ДНК. [c.361]

Клонирование фрагментов, полученных путем механического дробления, сопряжено с рядом технических трудностей в вектор легче встроить рестрикт. Однако сложность такого встраивания состоит в том, что сайты рестрикции могут находиться в неудобных местах, например в середине гена, который надо клонировать. Один из способов преодоления этой трудности состоит в использовании более чем одной рестриктазы, т.е. в повторении эксперимента с различными ферментами, сайты узнавания которых занимают разные положения. Но это требует дополнительного времени, и при работе с длинной последовательностью бывает сложно найти фермент, не разрезающий ее. [c.243]

В работах по генетике микроорганизмов часто используют термин клон , под которым подразумевают популяцию генетически родственных клеток, полученную неполовым путем из одной родительской клетки. В молекулярной биологии клоном называют множественные копии идентичных последовательностей ДНК, полученные при их встраивании в клонирующие векторы (например, плазмиды). Под термином генетически модифицированные , или рекомбинантные , штаммы понимают штаммы микроорганизмов, полученные в результате генно-инженерных манипуляций. Часто новые штаммы микроорганизмов получают с помощью мутагенов. [c.191]

Вакцинация, рекомендуемая тем, кто посещает эндемичные холерные области и живет там. Вакцина содержит убитые нагреванием вибрионы. Она эффективна лишь в 40—60% случаев, а искусственный иммунитет сохраняется примерно 3—6 месяцев. Однако повторная вакцинация (бустер-доза) быстро вызывает иммунологический ответ и обеспечивает защиту при вспышке эпидемии. Ведутся работы по созданию вакцины методами генной инженерии. Для этого необходимо идентифицировать и клонировать гены, кодирующие синтез токсина. Еще один многообещающий подход — получение низковирулентного (ослабленного, или аттенуированного) штамма вибриона, у которого один или два гена токсичности отсутствуют. [c.206]

По-видимому, это был первый случай в истории, когда о начале великой технологической революции возвестил биржевой колокол. В 1980 г., когда фирма Genente h впервые предложила обществу свои акции, это была небольшая компания в Калифорнии, в течение четырех лет успешно работавшая над проблемой получения рекомбинантных ДНК. За два года до этого ученым компании удалось выделить фрагменты гена (последовательности ДНК), кодирующие человеческий инсулин, и перенести их в генетические элементы (клонирующие векторы), способные реплицироваться в клетках обычной кишечной палочки Es heri hia oli). Эти бактериальные клетки работали как биологические фабрики по производству человеческого инсулина, который после соответствующей очистки мог использоваться как лекарственный препарат для больных диабетом, дающих аллергическую реакцию на свиной инсулин. Еще десять лет назад такое развитие событий представ- [c.15]

На начальном этапе исследований для создания гибридных ретровирусов чужеродные гены объединяли лишь с фрагментами ретровирусной ДНК, а затем по относительно сложной схеме получали гибридные вирусы. В одной из первых подобных работ Д. Солник с соавторами (1981 г.) сконструировали гибридный ретро-вирус, трансдуцирующий ген ik вируса простого герпеса. Для этого фрагмент, содержащий ген /A HSV-1, ковалентно пришили к фрагменту ДНК вируса саркомы мышей Харви, несущему информацию, необходимую для неопластической трансформации клеток. Такой гибридный фрагмент клонировали в составе ДНК векторного фага А. После введения в культуру клеток мыши ЗТЗ молекул ДНК полученного фага XHaSVikS образовались клоны трансформированных клеток. Отобранные морфологические трансформанты инфицировали ретровирусом Mo-MLV. Среди вирусного потомства выявили гибридные ретровирусы, которые обусловливали как генетическую трансформацию по признаку ТК , так и морфологическую трансформацию. Такие вирусы возникали в результате рекомбинационного процесса ш vivo. [c.402]

Ген металлотионеина представляет собой еще один амплифицируемый маркер, работа с которым подробно освещена в данной главе. Особенно хорошо изучен один из двух генов мыши m-mtl, этот ген невелик, и его геномную копию удобно клонировать в плазмидных векторах [8]. Попытки использовать данный ген в качестве доминантного селективного маркера окончились неудачей (кроме векторов на основе ВРУ [19]). Поэтому для первичной селекции требуется дополнительный маркерньп ген. Эти недостатки компенсируются в ряде случаев простым и недорогим методом селекции клеток на амплификацию мышиного гена rn-mtl, хотя число копий на клетку в этой системе не превышает 100. [c.244]

Векторы этого типа представляют собой производные Ti-плаз-мид дикого типа, из которых онкогены Т-ДНК были удалены и в некоторых случаях заменены на особый фрагмент ДНК, имеющий область гомологии с небольшим клонирующим вектором, способным реплицироваться только в Е. oli. Эта стратегия основана на коинтеграции в клетках А. tumefa iens между гомоло-гичны.ми областями на модифицированной Ti-плазмиде vir-хел-пере) и небольшом клонирующем (промежуточном) векторе Е. oli, содержащем селективный маркерный ген, который предназначен для работы в растительных клетках, и уникальные сайты для встраивания чужеродной ДНК- [c.20]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Векторы для клонирования. Очевидно, что уменьщение значения т приводит к пропорциональному увеличению значения п. Поэтому для создания банка генов, казалось, следует клонировать как можно более крупные фрагменть. ДНК. Однако чем длиннее фрагменты, тем труднее с ними манипулировать и сложнее их анализировать. Достав очно рутинны процедуры с молекулами ДНК размером до 50 т.п.н. Работа с молекулами ДНК длиной сзыше 100 т п н требует специальных методов и прибо- [c.270]

Прочтение генетического кода генома человека стало центральной проблемой молекулярной биологии и генетики в конце 80-х годов. Национальные программы Геном человека были приняты во всех странах с-развитой наукой, в том числе и в бывшем Советском Союзе. В итоге за 10 лет интенсивной работы мирового сообщества на рубеже третьего тысячелетия вчерне расшифрована нуклеотидная последовательность генома человека, созданы физические карты каждой из 23 хромосом, идентифицированы гены, ответственные за многие наследственные заболевания. Полностью завершено секвенирование более десятка геномов микроорганизмов, растений, низших и высших эукариот. Возникли новые науки - геномика и протеоми-ка. Успехи в этих областях во многом обусловлены возможностью клонировать ДНК в искусственных хромосомах дрожжей (YA ). [c.72]

Плазмида pBR322 оказалась настолько хорошим клонирующим вектором, что в течение ряда лет она использовалась в подавляющем большинстве генно-инженерных работ, в которых применялись плазмидные векторы. Кроме того, на основе плазмиды pBR322 получены другие векторные производные. [c.90]

Выполненные работы показали, что практически любой ген, по которому осуществлена генетическая трансформация клеток животных, можно вьщелить и клонировать в подходящем бактериальном векторе. В получаемом препарате гибридной ДНК доза данного гена намного [c.341]

Механизм комбинаций работает, но довольно плохо, т.е. поставляет антитела, связывающие антигены, но довольно слабо. Поэтому существует еще один механизм - соматический гипермутагенез, который включается после создания нужной комбинации фрагментов. Заключается он в том, что при клонировании гены найденного варианта мутируют с огромной частотой (тут каждый тысячный нуклеотид заменяется, тогда как обычно точковый мутагенез в 100 миллионов раз менее интенсивен), так что порождается масса чуть отличных антител, различающихся одной аминокислотой или двумя, чем и достигается точная подгонка антитела к антигену. Конечный вариант снова клонируется и запоминается иммуногене-тической системой организма (рис. 26), т.е. наследуется на время жизни особи. [c.190]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология