Аминокислотный анализ с помощью

Методическое руководство по биохимии и иммунохимии белка. Рассмотрены теоретические основы методов и современная аппаратура для гель-фильтрации, бумажной, ионнообменной н тонкослойной хроматографии, в том числе методы количественного аминокислотного анализа с помощью автоматических анализаторов. Подробно описан анализ производных аминокислот методом газовой хроматографии. Книга хорошо иллюстрирована и снабжена подробной библиографией. [c.4]

После того как установлена первичная структура- какого-либо белка, обычно нет необходимости проводить полное изучение аминокислотной последовательности у гомологичных белков из близких (соответствующих) источников. Быстрый ответ можно получить, используя технику трипсинового фингерпринта . Для этого подвергают гидролизу трипсином белок с известной структурой и параллельно ему гомологичный белок полученные в результате гидролиза пептиды разделяют обычно с помощью двумерного электрофореза или хроматографии. Если разница в последовательностях невелика, то больщинство пептидов должны занимать идентичное положение на двумерном фингерпринте. Те немногие пептиды, которые отличаются по подвижности, необходимо элюи-.ровать и подвергнуть аминокислотному анализу по Эдману. Эта техника особенно полезна при изучении аномальных гемоглобинов, которые отличаются от нормального природой только одного участка. [c.276]

Несмотря на общий характер метода энантиомерной метки, разработан он был главным образом для аминокислотного анализа с помощью ГХ. Все о-аминокислоты, вьшолняющие роль внутренних стандартов, имеются в продаже, а разделение смеси всех природных белковых ь-аминокислот и соответствующих о-энантиомеров можно [c.175]

При изучении небольших пептидов подходящим методом аминокислотного анализа, например с помощью автоматического аминокислотного анализатора, можно достаточно определенно установить состав пептида, лишенного своей концевой группы. Проследив за изменением аминокислотного состава на последовательных этапах деградации, можно восстановить аминокислотную последовательность изучаемого пептида. [c.283]

Отнесение резонансных линий в спектрах ЯМР к определенным атомам в макромолекулах является одним из наиболее важных условий надежного определения молекулярной структуры. Хотя в принципе для получения определенной информации о структуре достаточно провести отнесение небольшого числа резонансных линий, точность структурной информации возрастает с увеличением числа расшифрованных линий, так как в этом случае можно провести дополнительное сравнение результатов. С ростом надежности расшифровки спектров существенно возрастает также и надежность следующих из этого выводов, которые часто весьма чувствительны к ошибкам, допущенным при отнесении резонансных линий. Расшифровка спектров ЯМР протеинов, как правило, проводится в две стадии сначала пытаются выяснить, какие резонансные линии относятся к аминокислотному остатку, и при этом не заботятся о том, какое положение занимает данная аминокислота в протеиновой последовательности. Таким образом во многих случаях выясняют, о какой из аминокислот идет речь. Второй шаг состоит в том, чтобы определить место этой аминокислоты в протеиновой последовательности. Как правило, эта проблема решается с помощью независимых, биохимических методов либо с использованием биохимического аминокислотного анализа, либо косвенным путем - по восстановлению соответствующей последовательности в ДНК. Поскольку такая расшифровка спектров предполагает определение параметров, характерных для каждой последовательности аминокислот, то очевидно, что эффективность расшифровки спектров зависит от того, насколько правильно определена эта первичная структура. Неточности, допущенные в определении первичной структуры, могут быть обнаружены в результате сравнения с данными, полученными методом ЯМР. Эта расшифровка основана на сравнении расстояний, которые являются типичными для аминокислот, следующих одна за другой в последовательности. Одновременно соотношения между расстояниями используются для упорядочения элементов вторичной структуры, так что при таком последовательном отнесении резонансных линий можно получить информацию о вторичной структуре. [c.128]

Наконец, по возрастанию поглощения света в области 295 ммк, сопутствующему ионизации фенольных групп, было определено число остатков тирозина, которое оказалось равным 6, При pH 7,5 происходит изменение конформации макромолекулы, и две карбоксильные группы, скрытые до того внутри глобулы, становятся обратимо титруемыми. Всего в р-лактоглобулине найдено 53 карбоксильные группы. Таким образом, методом титрования могут быть изучены некоторые структурные особенности и переходы в белке. При рН>9,7 белок необратимо денатурирует. При низких значениях pH он диссоциирует на две субъединицы с молекулярным весом около 18 000 каждая. Результаты титрования согласуются с данными аминокислотного анализа белка, проведенного с помощью стандартных методов, с точностью до одного аминокислотного остатка. [c.115]

Для того чтобы определить число концевых групп на 1 моль белка, необходимо точно знать содержание белка в ДНФ-производ-ном. Воздушно-сухие ДНФ-белки обычно содержат около 70% белка, но нужно получить точные данные на основании аминокислотного анализа или определения амидного азота. Последнюю величину можно просто и быстро определить для ДНФ-белка и исходного белка при помощи метода, описанного на стр. 271. Другой возможный путь состоит в сравнении содержания трех или четырех различных аминокислот. [c.142]

Аминокислотный анализ обычно проводят при помощи автоматического анализатора аминокислот. Парциальные удельные объемы отдельных аминокислот [c.93]

По вопросу о связи между строением инсулина и его биологической активностью, а таклсе о значении отдельных частей молекулы инсулина для проявления активности имеются довольно обширные сведения. Так, отщепление С-концевого остатка цепи В бычьего инсулина (аланин), которое может быть осуществлено мягкой обработкой карбоксипептидазой [951, 1614] или трипсином [951], не сопровождается потерей гормональной активности. Напротив, отщепление С-концевого остатка цепи А (аспарагин) приводит к резкому снижению активности [951, 1614]. Дез-(Азр 21, А1а > )-инсулин был очищен с помощью противоточного распределения и охарактеризован аминокислотным анализом. Активность этого соединения в судорожном тесте на мышах составляла 5% (1,1—1,2 М. Е./жг) активности природного инсулина [2139]. [c.471]

Аминокислотный анализ только в последние годы стал достаточно точным для использования его в качестве критерия при установлении состава белка. При внимательном просмотре литературы, посвященной аминокислотам, обнаруживается, что в тех случаях, когда два или большее число исследователей анализировали один и тот же белок, предварительно проверяя применяемый метод с помощью достаточного числа контрольных анализов, то они нередко получали для некоторых аминокислот различные значения. [c.263]

Методики аминокислотного анализа с помощью ионообменной хроматографии 811 [c.140]

Количественное определение N-концевых аминокислот [15]. Количество белка в образце определяют с помощью аминокислотного анализа. Точную навеску в миллиграммах) лио- [c.35]

Для разделения используют легколетучие буферные системы, в частности разбавленные растворы аммиака, уксусную и муравьиную кислоты, что позволяет выделять белки из элюатов с помощью лиофильного высушивания. Препараты для аминокислотного анализа рекомендуется получать гель-фильтрацией в 50—75%-ной муравьиной кислоте. Муравьиная кислота, сильный денатурирующий и солюбилизирующий агент, вызывает разрушение носителей на основе полисахаридной матрицы в частности, не рекомендуется оставлять сефадексы в контакте с 75%-ной муравьиной кислотой на срок более трех недель. [c.37]

Аминокислотные анализы водных экстрактов образцов лунного грунта, проведенные в рамках американской программы Аполлон , показали присутствие глицина и аланина. Еще четыре аминокислоты были обнаружены с помощью газовой хроматографии в кислотном гидролизате экстракта. Это Glu, Ser, Asp, Туг. Спектроскопические данные одиозиачио показывают присутствие NH3, НСНО и H N в космическом пространстве. В луниых пробах также обнаружены исходные продукты для абиогенного образования внеземных аминокислот СН , Nj, СО, СО2, H N (20 — 70 нг/г). Возможно, правда, что часть предшественников аминокислот происходит от газов земных ракет. [c.48]

Анализ аминокислотной последовательности пептвдов и белков этим методом может выполняться вручную или с помощью специальных автоматических приборов — секвенаторов, использование которых в настоящее время значительно упростило процесс аминокислотного анализа. В сек-венаторах белок в виде тонкой пленки помещают во вращающийся цилиндрический сосуд, где он подвергается реакции по Эдману. Реактивы и растворители проходят над иммобилизованной белковой пленкой, а высвобождающиеся ФТГ-АК подвергаются жидкостной хроматографии при высоком давлении и таким образом идентифицируются. С помощью сек-венатора можно определить аминокислотную последовательность полипептида или белка, содержащего до ста аминокислотных остатков. [c.60]

Получающиеся дипептиды можно разделить с помощью ионообменной хроматографии подобно тому, как это делают при аминокислотном анализе, одиако при поточном расщеплении необходимо собирать фракции для дальнейшего анализа. Другой набор дипептидов можно получить, если перед обработкой дипептидиламино-пептидазой провести удаление iV-концевого остатка по методу Эдмана (один цикл). Так, если удалить iV-концевой Ser в -кортико-тропине, то должны образоваться другие дипептиды схема (21) . [c.272]

Для определения локализации дисульфидных связей белок подвергают частичному гидролизу на относительно малые фрагменты с помощью протеиназы низкой специфичности, такой как пепсин, в условиях, при которых протекает минимум обменных реакций. Пептиды разделяют и определяют их аминокисло гный состав для того, чтобы убедиться в том, что они гомогенны и содержат одну дисульфидную связь. Дисульфидная связь в каждом пептиде разрывается (см. разд. 23.3.3) и образуются два фрагмента. Если первичная структура белка известна, то достаточно аминокислотного анализа и частичного определения Л/-концевой последовательности в двух фрагментах для того, чтобы определить ту часть цепи (ей), из которой образовался каждый фрагмент. [c.280]

О)вершенно очевидно, что число необходимых для превращения стадий должно быть минимальным, так как в результате многочисленных операций могут происходить большие потери и воспроизводимость экспериментов будет ухудшаться. В идеале было бы желательно производить модификацию аминокислот в одну стадию, но в случае полифункциональных аминокислот, как правило, на это рассчитывать не приходится. Большое число реакций при модификации не выгодно и с другой точки зрения обычно в аминокислотном анализе используются очень небольшие количества материала — несколько микромолей или даже меньше. Следовательно, превращение аминокислот необходимо проводить на микроуровне. С помощью газохроматографических детекторов с обычной чувствительностью определять такие небольшие количества довольно легко. К тому же вполне возможно, по крайней мере теоретически, увеличить чувствительность методов детектирования. Поэтому в настоящее время основные трудности связаны не с газохроматографическим детектированием производных аминокислот, а с микропрепаративным превращением аминокислот. [c.310]

Были также разработаны ультрамикрометоды, основанные на сочетании двойного изотопного разбавления, бумажной хроматографии и электрофореза [193]. В настоящее время для полного аминокислотного анализа требуется только 2 мкг белка. Первоначально аминокислоты метили с помощью и содержащихся в г-иодфенилсульфонилхлориде, получая при этом их шипсильные производные [94]. Однако в дальнейшем оказалось более удобным получать изотопы с более длинным периодом полураспада для этого аминокислоты ацетилировали уксусным ангидридом, содержащим тритий и [193]. [c.402]

Молекулярный вес этих соединений очень велик. Вирус табачной мозаики, выделенный в кристаллическом состоянии [166], представляет собой нуклеопротеид с молекулярным весом порядка 40 млн. Палочконодобная молекула вируса имеет ядро из нуклеиновой кислоты, окруженное белковой оболочкой, которая может быть отделена. Первоначально с помощью физических методов определили, что молекулярный вес этого белка равен 100 ООО. Однако молекулярный вес, вычисленный на основании аминокислотного анализа, равен 17 ООО—18 ООО. В литературе имеется обзор, посвященный работам по структурному составу этого вируса [58]. [c.417]

Существуют различные методы выделения брадикинина из продуктов расщепления белков плазмы трипсином или змеиным ядом и его очистки, разработанные в различных лабораториях. Методика, применявшаяся Эллиоттом и сотр. [661, 666, 668, 669], заключалась в обработке фракционированной смеси белков из сыворотки быка 0,1 и. соляной кислотой при 37° (для инактивации ферментов, разрушающих брадикинин) и в последующей их инкубации с трипсином в течение 6 час. Полученную смесь осаждали спиртом, а из фракции, растворимой в 74%-ном спирте, чистый брадикинин удалось выделить с помощью противоточного распределения, хроматографии на, карбоксиметилцеллюлозе (ацетатно-аммониевый буферный раствор pH 6,5 и 5) и электрофореза. Сначала на основании неточных данных аминокислотного анализа считали, что брадикинин имеет следующий аминокислотный состав Ser Gly Pro Phe Arg= 1 1 2 2 2. Результаты кислотного гидролиза, расщепления химотрипсином и разложения по методу Эдмана позволили приписать бради-кинину следующую структуру [c.105]

С помощью аминокислотного анализа и метода Эдмана установили (Верле и сотр. [2470]), что каллидин имеет следующее строение [c.107]

Строение. Полимиксин Bi выделен из смеси антибиотиков, получившей название полимиксина В, после отделения компонента Вг с помощью противоточного распределения. В результате количественного аминокислотного анализа полимиксина Bi установлено, что в состав антибиотика входят 5 молей ь-а, у-ди-аминомасляной кислоты, 1 моль о-а, у-Диаминомасляной кислоты, 2 моля L-треонина, 1 моль о-фенилаланина, 1 моль L-лей- [c.560]

Конденсация фрагмента [Н (1 —2 )-6—8] с ранее описанным пентапептидом (Н 1—5) с помощью карбодиимидного метода привела с выходом 40% к разветвленному декапептиду [I (1 — 2 )-1—8], охарактеризованному количественным аминокислотным анализом и УФ-спектром. Формильную группу отщепляли действием 4 н. метанольного раствора НС1 в трифторуксусной кислоте или диметилсульфоксиде в течение 20 час при 20 [К ( —2 )-1—8] [2392]. Освободившуюся аминогруппу вновь количественно идентифицировали колориметрическим нингидриновым методом. Последующее омыление сложного эфира проводили обработкой 1,5-кратным избытком 1 н. едкого натра в диметилсульфоксиде в течение 20 час [L(l —2 )-1—8] образовавшуюся свободную карбоксильную группу определяли микротитрованием. Циклизацию синтезированного разветвленного декапептида осуществляли путем перемешивания при 20° раствора декапептида с 300-кратным избытком N, N -дициклогексилкарбодиимида в условиях высокого разбавления, причем выход неочищенного продукта реакции составил 20%. Защитные группы отщепляли действием натрия в жидком аммиаке. Полученный циклический пептид был очищен путем противоточного распределения (400 переносов вго/7-бутанол/0,1 н. соляная кислота) и хроматографирования на целлюлозном порошке (н-бутанол/ пиридин/ледяная уксусная кислота/вода, 30 20 6 24 м-бута-нол, содержащий 15% уксусной кислоты) с последующим обессоливанием на амберлите ШС-50 (ХЕ-64) в Н+-форме. [c.566]

Блок и Боллинг [За] опубликовали недавно монографию, в которой содержится описание многих методов, а также данные об аминокислотном анализе белков, главным образом с точки зрения вопросов питания. Их рабсига во многих отношениях дополняет настоящий обзор, в котором мы попытаемся дать критическое обсуждение методов, при помощи которых мы можем надеяться получить точные данные об аминокислотном составе индивидуальных белков. [c.47]

Современные направления в аминокислотном анализе стремятся избегнуть методов разделения с участием твердых фаз, которые медленно достигают равновесия, трудно регулируемы и являются неудобными для повторения фракционирования (например, фракционированной кристаллизации, которая является чрезвычайно трудоемкой процедурой). Аминокислоты в растворах можно перемещать в заданном нап эавлении в электрическо.м поле. Равновесие может быть быстро достигнуто ири использовании ионного обмена или адсорбции из растворов на твердой поверхности, пли распределения между двумя жидкими фазами, позволяющими применить хроматографические методы. Ионофоретический и хроматографический методы имеют особые преимущества, так как с их помощью концентрирование и очистка могут быть проведены сравнительно простылги приемами. В комбинации они, вероятно, представляют собой весьма плодотворный метод анализа. Они имеют особые преимущества перед методами, дающими определение отдельных аминокислот, так как позволяют обнаружить новые неожиданные аминокислоты в смеси. [c.62]

Бумажная хроматография и электрофорез. Эти методы дополняют и уточняют результаты аминокислотного анализа, полученные при помощи автоматического анализатора. В свое время благодаря разработке Консденом, Гордоном и Мартином метода бумажной хроматографии удалось создать несколько точных количественных методов определения аминокислотного состава белков и пептидов По технике исполнения и обработки результатов сюда же близко примыкает метод бумажного электрофореза [c.69]

После аминокислотного анализа пептидов часто проводят их концево анализ, что в случае ди- итрипептидов дает возможность сразу определить последовательность аминокислот. Для изучения аминокислотной последовательности часто пользуются методом Эдмана — ступен чатым расщепление.м пептида с его аминного конца с помощью фенилизотиоцианата (фиг. 7). Этот метод применим и для негидролизованных вирусных белков, если К-конец у них свободен. В настоящее время в продаже появились автоматические секвенаторы аминокислот, работающие на том же принципе. [c.73]

В тех гликопротеинах, где углевод-пептидная связь осуществляется через остатки серина и (или) треонина, аминокислотные остатки, включенные в эту связь, могут быть обнаружены методом, основанным на характерной реакции -элиминирования (см. стр. 289), которая наблюдается при обработке гликонротеинов и гликопентидов в мягких щелочных условиях. Механизм р-элиминирования обсуждается более полно на стр. 291 и сл. Если провести аминокислотный анализ кислого гидролизата гликопротеина до и после обработки гликонротеина щелочью, то значительное уменьшение количеств серина и (или) треонина, вызываемое щелочной обработкой, может рассматриваться как хороший довод в пользу участия остатков одной или обеих аминокислот в углевод-пептидной связи. Более того, а-аминоакриловая или а-аминокротоновая кислоты, образующиеся из связанных О-гликозидноп связью остатков серина и треонина соответственно, могут быть восстановлены водородом в присутствии платины на угле [21] или борогидридом [22] до соответствующих насыщенных а-аминокислот. Образовавшиеся непредельные а-аминокислоты могут быть также превращены с помощью сульфита в цистеиновую кислоту (из серина) или соответствующее производное треонина [19] можно измерить, кроме того, характерное поглощение непредельных аминокислот в УФ-свете [20]. [c.279]

Смит и др. [152] исследовали три обычных подтипа гаптоглобина с целью определения N-концевых групп. Во всех случаях были идентифицированы валин и изолейцин, что указывает на присутствие в молекуле гаптоглобина двух полипептидных цепей. После восстановительного расщепления гаптоглобина с помощью меркаптоэтапола в мочевине [150, 151] было установлено, что одна из полипептидных цепей, изолейцил- или -цепь, идентична во всех подтипах гаптоглобина, а валил- или а-цепи различны по свойствам при электрофорезе на различных системах крахмального геля. Аминокислотный анализ и исследование пептидов, полученных в результате обработки гаптоглобина химотрипсином [151], показали, что наблюдаемые различия частично могут быть обусловлены замещением аминокислот. [c.252]

Из экстрактов костного порошка был выделен гомогенный гликопротеин с высоким содержанием N-ацетилнейраминовой кислоты и гексоз (табл. 2). Из гексоз в гликопротеине идентифицированы галактоза, манноза и глюкоза галактозамин составлял 49% общего количества гексозаминов. С помощью качественного аминокислотного анализа в гликопротеине обнаружено 14 аминокислот [37J. Отмечено некоторое химическое сходство этого гликопротеина с aj-кислым гликопротеином плазмы крови быка однако, по-видимому, гликопротеин кости образуется в кости, а не попадает в нее из плазмы [44]. [c.266]

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенирования и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности можег быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезамидирования амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина. [c.16]

Методика. Электрофорез проводят в пластине геля в лунки вносят пробы исследуемого белка (например, 1, 2,. .., 40 мгк) исходную концентрацию белка определяют рефрактометрически, взвешиванием, спектрофотометрически или по данным аминокислотного анализа гель окрашивают по методике, описанной в разд. 1.2.1.1. Каждый трек сканируют на денситометре при Ятах = 590—595 нм ( 1п = 400 нм). Площадь пика определяют с помощью интегратора или путем взвешивания диаграммной бумаги, ограниченной кривой [61]. В области [c.62]

L5.2.3, Изопептиды. Наиболее известным изопептидным фрагментом, связывающим полипептидные цепи в белках, является К -( у-глутамил) лизин [107, 117]. После полного ферментативного гидролиза белка или смеси пептидов этот фрагмент можно идентифицировать с помощью аминокислотного анализа. На кривой элюирования ему соответствует пик в области изолейцина. Однако полное разрешение достигается лишь в особых условиях, например в буфере с pH 4,8. Относителыю возможной роли Ы"-( -аспартил)лизина как сшивающего фрагмента см. работу [92]. [c.72]

Показано, что в кислой среде 5-карбоксиметилцистеин (1) может подвергаться внутримолекулярной циклизации с образованием замещенного тиазина (2), который невозможно обнаружить с помощью аминокислотного анализа из-за потери [c.84]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология