Сорбенты для хроматографии аффинной

Ферментативные системы, связанные с функцией кофермента В12, достаточно сложны. В связи с этим имеется несколько сообщений об очистке В12-зависимых ферментов или В12-связывающих белков с помощью аффинных сорбентов, обладающих сродством к витамину В12. Фактически для очистки ферментов или белков аффинная хроматография широко используется как один нз наиболее привлекательных методов [270]. С этой целью был разработан метод синтеза нерастворимого носителя кобаламинсефарозы (рис. 6.14). Этот носитель использован для очистки М-5-метилтетрагидрофолатгомоцистеин1юбаламинмстилтрапс-феразы из Е. oli. [c.394]

Для иллюстрации изложенных в предыдущем разделе обш их соображений и возможностей использования различных аффинных сорбентов рассмотрим определенное число примеров, отобранных из периодической научной литературы последних трех лет. Большая их часть относится к очистке ферментов клеточного метаболизма (и отдельно — белков, регулирующ,их активность нуклеиновых кислот). Далее будут приведены примеры аффинного фракционирования и очистки самих нуклеиновых кислот, в том числе на иммуносорбентах. Основное внимание уделим более простому и универсальному методу — неспецифической элюции, однако био-снецифическая аффинная элюция белков тоже будет представлена несколькими типичными примерами. Рассмотрение начнем с использования сорбентов с индивидуальной специфичностью, ограничившись здесь тремя примерами, поскольку нет смысла пытаться сколько-нибудь полно иллюстрировать бесчисленное разнообразие возможных сорбентов этого типа. Аффинная хроматография белков клеточного метаболизма на сорбентах с групповой специфичностью будет иллюстрирована подробнее, а затем последуют два примера использования ковалентной хроматографии. [c.412]

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице. [c.11]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации. Эти методы рассмотрены ниже наряду с аффинной хроматографией на колонках. [c.11]

Морфин можно связать с матрицей и на полученном сорбенте проводить аффинную хроматографию. [c.552]

Наиболее важным неорганическим нерастворимым носителем без сомнения является стекло, которое очень часто используется для приготовления иммобилизованных ферментов и реже сорбентов для аффинной хроматографии. В табл. 8.7 перечислены марки некоторых хроматографических пористых стекол и фирмы, производящие их. [c.208]

На практике нередко возникает такая ситуация, когда уже готовая колонка с аффинным сорбентом оказывается загруженной лишь на малую долю своей эффективной емкости. Весь препарат в этом случае сорбируется в верхнем тонком слое сорбента. Для динамического хроматографического фракционирования это хорошо, но в обычном варианте статической аффинной хроматографии такая ситуация невыгодна уже тем, что в процессе элюции, продвигаясь по всей длине колонки, полоса очищенного вещества будет расширяться хотя бы за счет продольной диффузии в элюенте. Проблема легко разрешается — перед началом элюции снабженную адаптором колонку следует перевернуть и элюировать обратным током жидкости. [c.403]

Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упомина.лось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. В таком случае следует элюцию вести в свободном объеме, промывая сорбент на фильтре (с периодическим перемешиванием). Заметим, что промывку сорбента в объеме выгоднее вести несколько раз небольшими пори иями элюента, чем сразу большим его объемом. Аффинная хроматография в свободном объеме удобнее, чем колоночная, и в том случае, когда нужный белок очень мало представлен в неочищенном экстракте, но хорошо связывается сорбентом. Хроматография в объеме позволяет использовать такую концентрацию суммарного белка в экстракте, с которой из-за вязкости было бы трудно работать на колонке. Аффинная сорбция в объеме широко ис1ю.1гьзуется в радио-иммунных методах исследования. [c.409]

В статическом варианте аффинной хроматографии препарат на сор- бент часто вносят в объеме, перемешивая его раствор с суспензией сорбента, а затем уже переносят в колонку (или отмывают и элюируют на фильтре). Можно вносить раствор препарата и на колонку. Количество белка в исходном препарате (или объем колонки при заданном количестве белка) следует выбирать, стремясь, с одной стороны, к максимальной загрузке сорбента, но при условии сохранения соотношения [.Ё о]< [ ]. С другой стороны, увеличение загрузки требует и заметно большей длительности операции посадки белка (или НК) на сорбент. Дело в том, что закрепление крупных молекул белков на лигандах загромождает поры и каналы внутри гранул, [c.401]

В справочнике с наибольшей полнотой приведены вырабаты-, ваемые промышленностью многих стран мира неорганические и органические сорбенты, носители, жидкие фазы и другие материалы для всех видов хроматографии — всего приблизительно 6000 марок и сортов. Даются состав, химические и физические свойства, основные количественные характеристики материалов, а также рекомендации по применению (с ссылками на специальную литературу). Описаны новые классы материалов для хроматографии поверхностно-пористые сорбенты и носители, сорбенты с привитыми фазами (типа щеток ), биоспецифические сорбенты для аффинной хроматографии. [c.2]

Реакция конденсации идет при комнатной температуре с перемешиванием суспензии в течение ночи. По окончании ее сорбент обильно промывают 50%-ным этанолом, 3—4 объемами 1 М Na l и, наконец, деионизованной водой. Блокировать оставшиеся свободными спейсеры нет нужды впрочем, это можно сделать так же, как прп пспользованпи карбодиимида. Хранят сорбент уравновешенным буфером для аффинной хроматографии на холоду, с добавкой бактериостатического агента. [c.384]

Применение поперечносшитых агарозных гелей в общем аналогично применению таких же гелей с водородными мостиками (см. разд. 29). Преимущества сшитых гелей, наиболее полно выявляются при использовании их для получения биоспецифических сорбентов для аффинной хроматографии (см. носители Affi-Gel, разд. 120). [c.62]

Поэтому мы начнем изложение с краткой характеристикп используемых в настоящее время компонентов аффинных сорбентов матриц, лигандов и спейсеров. Одновременно рассмотрим способы соединения их между собой, ограничившись только теми немногими пз большого числа вариантов, испробованных и описанных в прошлом десятилетии, которые выдержали проверку временем. Впрочем, к ним имеет смысл добавить два-три только что предложенных способа, обещающих какие-то новые преимущества. Затем можно будет проанализировать более подробно параметры и характерные особенности процесса аффинной хроматографии и на основании этого анализа сформулировать некоторые рекомендации по практической постановке эксперимента. [c.342]

Групповой сорбент. для аффинной хроматографии полисахаридов, гликопротеидов и гликопептидов, а также моносахаридов. Лкгапд сорбента — конканавалин А — гем-агглютирующий металлопротеин растительного происхождения, выделенный из канавалии мечевидной. Лиганд специфически реагирует в присутствии Мп - и Са +) с углеводами, содержащими терминальные а- [c.226]

Активация бромцианом обычно требует высоких значений pH (10,5—11,5), но сочетание амина с активированным полисахаридом можно легко осуществить в 0,1М ЫаНСОз. Именно этот метод в основном используется при получении сорбентов для аффинной хроматографии ( uatre asas, 1970). [c.152]

Теперь можно вернуться к процедуре посадки лиганда на матрицу. После окончания инкубации необходимо блокировать не использованные в реакции с лигандом активные группы матрицы. Для этого сорбент переносят в 1 М раствор этанола.мина или 0,2 М раствор глицина при pH 8 и снова перемешивают, как при посадке лиганда. Наконец, для удаления избытков лиганда и блокирующих агентов гель промывают на воронке 4—5 раз попеременно кислым и щелочным буферами, например 0,1 М Na-ацетатным (pH 4) и буфером. используемым для посадки лиганда, добавляя в оба буфера до 0,5 М Na l. Чередование pH при промывке способствует десорбции неспецифическп сорбированного на матрице материала. Промытый аффинный сорбент переводят в буфер для хроматографии и хранят на холоду. [c.377]

В книге дан подробный анализ современных технических приемов хроматографии и возможностей н0ве11Ш011 аппаратуры, а также полный справочный материал по обменникам и сорбентам.. Анализируются последние достижения в гель-фил5,трации, распределительно , адсорбционно , ионообменной, аффинной и тонкослойной хроматографии. В каждом из методов наряду с обычно хроматографией рассмотрены достижения ыетодов высокоэффективной хроматографии при высоком давлении в колонках и на микропластинках. [c.2]

Эти соображения в определенно степен сохраняют свою силу и при использовании низкомолекулярных лигандов, если в ходе аффинной хроматографии на них будут сорбироваться белки. Разумеется, ситуация здесь лучше, так как на поверхности белка может быть лишь небольшое число аффинных центров связывания, а действующие здесь силы уступают ковалентным связям, поэтому денатурации белка при посадке на аффинный сорбент опасаться не приходится (мы сейчас оставляем в стороне возможность связыва- [c.386]

Очевидно, что такой сорбент частично сохраняет анионные свойства за счет остаточных свободных аминогрупп АЕ-целлюлозы, поэтому аффинную хроматографию следует вести в присутствии достаточной концентрации соли, блокирующей неспецифическую ионную сорбцию по этим группам [Feist, Danna, 1981]. Использование этого сорбента для разделения меркурированной и немеркурированной РНК рассмотрено ниже как пример применения аффинной хроматографии. [c.397]

В числе аффинных сорбентов, выпускаемых той и е фирмой, есть еще один, предназначенный также для ковалентной хроматографии. В отличие от всех предыдущих он па конце довольно длинного спейсера несет атом ртути, охотно связывающий меркаптосоедюшния. Такой сорбент мончно использовать, например, для выделения из смеси пептидов, содержащих цистеин [c.397]

Смит II соавторы с помощью аффинной хроматографии очищали рецептор прогестерона человека. Содержание рецептора в матке составляет лишь 0,002% суммарного белка, и оп весьма лабилен. В качестве лиганда использовали 11-дезоксикортикостерон. Гормон сажали на Br N-активнрованную сефарозу 41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Полученный таким образом аффинный сорбент инкубировали 18 ч с частично очищенным цитозолем матки, промывали 0,4 М КС1 и элюировали мкМ раствором меченного тритием прогестерона. Рецептор выходил в комплексе с гормоном. Операция обеспечивала очистку в 10 ООО раз. Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al., 1981). [c.434]

Аффинная хроматография НК на сорбентах, лигандами которых являются тоже нуклеиновые кислоты, базируется на их комплементарном взаимодействии с образованием достаточно прочных двунитевых структур — двунитевых ДНК и РНК нли ДНК—РНК-гибридов. Такие структуры образуются и надежно сохраняются лишь тогда, когда строго комплементарные участки имеют протяженность в десятки нуклеотидных звеньев. Эта степень соответствия не может быть случайной, а реализуется только в том случае, когда одна из НК была синтезирована по матрице второй НК (или ей идентичной). Разумеется, как иммобилизованная НК, так и очищаемая должны быть однонитевыми, а условия связывания с сорбентом должны быть благоприятными для их гибридизации. [c.441]

Даже при статическом варианте аффинной хроматографии не рекомендуется использовать более 15—25% эффективной емкости колонки для данного вещества. Под эффективной удельной емкостью сорбента условимся понимать максимальное количество вещества, например белка, которое может связаться с ним (в расчете на 1 мл) нри перемешивании в свободном объеме за достаточное для установления равновесия время, так что в жидкой фазе концентрация этого вещества будет оставаться практически нулевой. Эффективную удельную емкость сорбента для чистого сорбируемого вещества (аф- [c.402]

Вообще тщательную промывку аффинного сорбента перед его использованием, а особенно после длительного хранения следует предусмотреть в любом варианте аффинной хроматографии. Дело в том, что при хранении идет медленный гидролиз связей лигандов с матрицей, приводящий к освобождению, или подтеканию , лигандов ( leakage , bleeding ). Это явление опасно не уменьшением емкости сорбента (на доли процента), а тем, что перешедшие в раствор молекулы лиганда могут оказаться на два-три порядка более активными в отношении связывания вещества, чем иммобилизованные молекулы. Это создает ситуацию конкурентной элюции в тот момент, когда должна происходить посадка вещества на сорбент. Результатом такой ситуации может оказаться заметное уменьшение и даже полное отсутствие задержания вещества на сорбенте. Подтекание лигандов может происходить не только за счет отрыва их ковалентно связанных молекул от матрицы, но и в результате постепенной десорбции тех молекул лиганда, которые не были отмыты после посадки его на матрицу. [c.410]

Смотреть страницы где упоминается термин Сорбенты для хроматографии аффинной: [c.182] [c.71] [c.209] [c.220] [c.151] [c.11] [c.54] [c.60] [c.61] [c.340] [c.343] [c.368] [c.375] [c.400] [c.402] [c.413] [c.418] [c.422] [c.424] [c.430] [c.432] [c.443] [c.443] [c.444]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология