Пронуклеусы

Рис. 19.2. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций. Яйцеклетки выделяют из са-мок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в суррогатную мать, которая производит на свет трансгенных мышат — основателей трансгенных линий.

Центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа. [c.433]

Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус. [c.433]

Из яйцевода оплодотворенных самок извлекают яйцеклетки, находящиеся на стадии двух пронуклеусов. [c.507]

В мужской пронуклеус вводят 10 л раствора чужеродной ДНК (плазмиды или целевые гены с дополнительными последовательностями, необходимыми для экспрессии). [c.507]

Микроинъекции гена. Получение трансгенных животных путем микроинъекции гена включает извлечение эмбрионов на стадии пронуклеуса хирургическим путем или после убоя доноров. Для получения оплодотворенных яйцеклеток, необходимых для микроинъекции, у животных гормональной обработкой вызывают суперовуляцию по 226 [c.226]

Для микроинъекции эмбрионов необходим стабильный рабочий стол, на который устанавливают инвертированный микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. Для инъекции эмбрионы по мере надобности посредством пониженного давления фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором ДНК. Для инъекции пипетку через прозрачную оболочку и клеточную мембрану вводят в пронуклеус, после чего в него инъецируют 1—2 пкл раствора ДНК. О точности операции судят по набуханию пронуклеуса. Только такое визуальное увеличение объема ядра свидетельствует о том, что раствор ДНК был действительно введен в пронуклеус. После инъекции эмбрионы освобождаются от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам. [c.227]

Пронуклеус — ядро (мужское, женское) оплодотворенной яйцеклетки. [c.465]

Оплодотворение (стадия пронуклеуса [c.258]

Сфокусируйте объектив на пронуклеусе. Подведите кончик инъекционной пипетки к оболочке яйцеклетки. Перемещая при помощи микроманипулятора инъекционную пипетку в вертикальной плоскости, установите ее на одном уровне (т. е. в той же фокальной плоскости) с пронуклеусом. [c.339]

Уколите яйцеклетку, оболочка легко прокалывается инъекционной иглой. Когда игла окажется внутри пронуклеуса, нажмите на поршень инъекционного шприца. Далее ожидается одно из трех возможных последствий 1) Пронуклеус начинает набухать. Это свидетельствует об успешной инъекции продолжайте двигать поршень, пока пронуклеус ые увеличится в объеме примерно вдвое (рис. 10.10,6), затем быстро выньте инъекционную пипетку. 2) Небольшой прозрачный пузырек появляется у конца инъекционной пипетки и оболочка яйцеклетки набухает. Следовательно, осталась непроколотой мембрана яйцеклетки, которая очень эластична. Чтобы проткнуть мембрану, продолжайте перемещать иглу внутрь яйцеклетки цо его противоположной стороны, затем подвиньте ее назад таг , чтобы кончик оказался снова внутри пронуклеуса, и продолжайте вдвигать поршень шприца. 3) Ничего не происходит, Это, вероятно, следствие закупорки иглы. Замените иглу и, если это необходимо, раствор ДНК. [c.339]

Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназного вируса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Выживает обычно от 10 до 30 % яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток, составляет от нескольких до 40 %. [c.127]

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским проггуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный экспериментатор за день может инокулировать несколько сотен яйцеклеток. [c.421]

Впервые возможность переноса ДНК при помощи микроинъекций в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыщи была проиллюстрирована Дж. Гордоном и др. В этом эксперименте в несколько сотен оплодотворенных яйцеклеток инъецировали плазмидный вектор pBR322, содержащий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) и часть генома обезьяньего вируса 40 (SV40). Из 78 потомков, рожденных приемными матерями, два содержали плазмидную ДНК. Авторы сделали вывод, что эти данные свидетельствуют о возможности использования рекомбинантных плазмид в качестве вектора для введения чужеродных генов непосредственно в эмбрионы мыщей, которые сохраняют эти гены в ходе развития . К сожалению, плаз- [c.428]

Трансгенньгх мышей получали микроинъекцией в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ES-клеток с помощью YA , несущих несколько родственных генов или один большой ген. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти функциональных генов Р-глобина человека суммарной длиной примерно 250 т. п. н., экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время - точно так же, как это происходит у человека. Такое соответст- [c.428]

Микроинъекцгш ДНК в оплодотворенные яйцеклетки птиц с целью получения трансгенных линий - непростая процедура. Это связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микроинъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками. [c.436]

Однако трансген можно вводить в область желтка (зародышевый диск), который содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образуется раньше, чем скорлупа. После введения ДНК каждую яйцеклетку культивируют in vitro, и когда образуется зародыш, его помещают в суррогатное яйцо, чтобы имитировать вылупление. При помощи такой стратегии была получена одна линия трансгенных цыплят. Однако в настоящее время этот метод неэффективен и технически трудновыполним в обычных условиях. [c.436]

По мере истощения природньгх рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных условиях. Основная цель исследований в этой области — создание рекомбинантных рыб путем трансгеноза. До настоящего времени трансгены вводили микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб — карпа, зубатки, форели, лосося и т. д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке плохо различим в обычный микроскоп, линеаризованную трансгенную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмбрионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необходимости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока, от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 10 до 70%. Трансген можно обнаружить с помощью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Скрещивая трансгенных рыб, можно вывести трансгенные линии. [c.438]

В 1980 г. Верховный суд США вынес определение, что изобретение, которое включает что-либо, созданное под солнцем руками человека , является охраноспособным. В 1988 г. было запатентовано первое животное, полученное с помощью методов генной инженерии, — трансгенная мышь. В ее ДНК бьш встроен ген, ответственный за образование злокачественных опухолей (онкоген), который находился под контролем промотора на основе длинного концевого повтора вируса опухоли молочных желез мыши (ЬТЯ ММТУ). Онкоген представлял собой ген туе вируса миелоцитоматоза цыпленка ОКЮ. Изобретение заключалось в клонировании химерного гена ЬТК ММТУ—т>>с в плазмиде, введении линеаризованной плазмидной ДНК в мужской пронуклеус оплодотворенных одноклеточных мышиных яйцеклеток, идентификации потомков, экспрессирующих ген туе, и получении линий трансгенных мышей. У животньгх одних линий ген туе экспрессировался в различных тканях, у животных других экспрессия ограничивалась одной или несколькими тканями. По утверждению Ледера [c.538]

Клонирование ( loning) Совокупность процедур, использующихся для получения клонов. Клонирование многоклеточных организмов, например, включает пересадку ядер соматических клеток в оплодотворенное яйцо с удаленным пронуклеусом. [c.550]

Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в частности,с соматотропином, или гормоцом роста) оказались важными для животноводства (возрастание привесов животных, лактации) Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые клетки млекопитающих (в пронуклеусы оплодотворенных ооцитов, или в яйцеклетки) удается получать так называемых транс-генных животных Клоны реципиентных клеток, содержащие донорный хромосомный материал, или трансгены, различаются по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная активность и регуляция экспрессии клонированных генов изучаются на целом организме, то и говорят о трансгенном организме Схема получения, например, трансгенных мышей введением клонированной ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо приведена на рис 72 [c.209]

Как только активированный спермий морского ежа прикрепляется к яйцу, акросомальный отросток быстро прокладывает себе путь через вителлиновьй слой. Мембрана на кончике отростка сливается с плазматической мембраной яйца, н ядро спермия переходит в яйцо. Уже в первые полчаса ядра спермт и яйцеклетки (называемые пронуклеусами) сливаются, воссоздавая диплоидное ядро. Оплодотворенную яйцеклетку называют зиготой. [c.44]

Нужно столь же осторожно пользоваться термином инактивация спермы , как мы это делаем в отношении термина стерильность насекомых . Фактически инактивация спермы может быть обусловлена тремя различными факторами 1) полностью лишенной подвижности спермой 2) неспособностью сперматозоидов проникнуть в яйцо и 3) невозможностью слияния пронуклеусов или неспособностью функционировать при сингамии. Эти три возможности совершенно различны, и эта разница не только теоретическая, а может существенным образом отразиться на использовании хемостерилизаторов в программах борьбы с вредными насекомыми. Действие этих трех типов инактивации спермы и то, как они будут отражаться на некоторых видах насекомых, показано в таблице 5. Один из типов инактивации спермы (3) может быть определен как присущий партеногенетически размножающимся видам, но он обязательно связан с доминантными летальными мутациями у других видов насекомых. К сожалению, мы не знаем, какой тип инактивации вызывают те или иные хемостерилизаторы, а также насколько важным может быть этот тип сте- [c.133]

После того как закончится формирование желтка, фолликулярные клетки выделяют хорион, но оставляют в нем отверстие, микропиле, чтобы облегчить проникновение сперматозоида. Наконец, яйцо прорывает фолликулу, спускается по яйцеводу, принимает сперму из сперматеки и откладывается. По-видимому, наличие сперматозоида в яйце стимулирует деление его ядра на четыре гаплоидных ядра. Одно из них становится женским пронуклеусом и, сливаясь с ядром сперматозоида, образует зиготу. [c.137]

Наблюдения Геншоу (1940) на фиксированном материале показали, что вызванная облучением задержка делений обусловлена главным образом затягиванием профазы. Стадии, предшествующие профазе (оплодотворение, сближение мужского и женского пронуклеусов и их слияние), не замедлены, тогда как более поздние стадии деления (метафаза, анафаза и телофаза), хотя и замедлены, но в значительно меньшей степени, чем профаза . Поэтому мы предполагаем, что действие облучения сводится к затруднению конденсации хромосом в профазе и что завершение профазы означает завершение процесса восстановления. Экспериментальные данные, показанные на рис. 47 (П. С. Геншоу и Коэн, 1940), находятся в согласии с этим предположением. В экспериментах оплодотворенные яйца облучали рентгеновыми лучами в различные моменты, начиная от О до 35 мин после оплодотворения, так что облучению подвергались яйца, находившиеся на разных стадиях развития, вплоть до конца профазы. Можно заметить, что данная доза производит максимальный эффект, если облучение производится через 10—15 мин после оплодотворения, т. е. когда слияние пронуклеусов уже произошло, и непосредственно перед видимым началом про- [c.217]

Ядро спермия увеличивается в размерах, поскольку хроматин ядра становится менее конденсированным. На этой стадии ядра спермия и ооцита второго порядка называют пронуклеусами. [c.87]

Мужской пронуклеус сливается с женским пронуклеусом. В этом и состоит подлинный акт оплодотворения. Обрузую-щееся в результате новое ядро содержит два набора хромосом — один от яйцеклетки и один от спермия. Клетка теперь стала диплоидной и ее назьшают зиготой. Новое ядро немедленно делится митотически. А затем зигота претерпевает цитокинез (клеточное деление) с образованием двух диплоидных клеток. [c.87]

Если необходимо, чтобы все ютетки животного содержали новый ген, этот ген нужно ввести в яйцеклетку. Сначала у самки с помощью гормональных препаратов стимулируют образование дополнительных яйцеклеток. Затем оплодотворенные яйцеклетки извлекают из организма матери и с помошью очень тонкой иглообразной пипетки под контролем микроскопа донорную ДНК вводят в один из пронуклеусов. Процесс введения изображен на рис. 25.16. В некоторьгх (но не во всех) случаях ДНК действительно встраивается в одну или несколько хромосом. Позднее два пронуклеуса сливаются, и яйцеклетка превращается в зиготу. Зиготы переносят в организм одной или нескольких приемных матерей (максимум, два потомка на одну мать), а потом проводят скрининг потомства на присутствие нового гена. Лучший результат, которого удалось добиться в настоящее время, — это одно трансгенное животное на каждые 20 обработанных яйцеклеток в случае овец или 100 яйцеклеток в случае коров. Следовательно, для проведения экспериментов нужно содержать большое [c.234]

Рис. 25.16. Микроинъе ция ДНК в яйцеклетку. Ядра мужской и женской гамет еще не слились и на этой стадии называются пронуклеусами. Они видны в центре яйцеклетки. ДНК вводят в один из пронуклеусов с помощью очень тонкой иглообразной пипетки (справа на фотографии). Яйцеклетку придерживают в устойчивом состоянии с помощью другой пипетки (слева). В яйцеклетку вводят несколько сотен копий фрагмента ДНК.

Одной из причин может быть то, что при созревании ооцита in vitro в цитоплазме не вырабатывается в достаточной мере фактор, контролирующий формирование и развитие мужского пронуклеуса. Считают, что для появления в цитоплазме ооцита фактора, вызывающего созревание мужского пронуклеуса, необходимо обеспечить индуктивное влияние нормального окружения ооцита в фолликуле в течение не менее 6 ч после начала мейотического созревания. [c.210]

В оплодотворенных яйцеклетках мыши и кролика, извлеченных в соответствии со стадией их развития, пронуклеусы очень хорошо видны и могут быть легко инъецированы. У эмбрионов сельскохозяйственных животных в цитоплазме имеются темные липидсодержащие гранулы, которые затрудняют визуализацию пронуклеусов. В результате центрифугирования при 15000 g в течение 3—5 мин (Wall R.J. et al., 1984) гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклетки, а лежащие недалеко от центра пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций. Для эмбрионов овцы, как правило, не требуется центрифугирования для визуализации пронуклеусов достаточно применить оптику Номарского с интерференционным контрастом. Несмотря на такую обработку, микроинъекция эмбрионов сельскохозяйственных животных все же сложнее и не может быть выполнена с такой же надежностью и эффективностью, как у мышей и кроликов. [c.227]

Д ля образования трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких трансгенных животных (трансгенные особи, родившиеся из инъецированных эмбрионов), все или, по крайней мере, часть половых клеток которых содержат трансген. При исследовании родившихся животных и полученного от них потомства было показано, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях (в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток), могут появляться мозаики. Мозаиками считаются животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющих различные генотипы. Трансгенные мозаики кроме клеточных линий, содержащих трансген, имеют нетрансгенные линии. При получении от таких животных трансгенного потомства и при выделении трансгенных линий могут возникнуть трудности. Так, если клетки гонад не содержат трансген, потомство не может наследовать инъецированный ген от трансгенной родительской формы. На основании существующих данных можно сделать вывод, что около 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаиками (Wilki Т.М. е1 а ., 1986). Поэтому трансген не передается потомству с ожидаемой согласно закону Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству. [c.228]

Метод трансфекции успешно применяется для введения генов в геном животных (рис. 38.14). Плазмиды, несущие интересующий исследователей ген, вводятся в зародышевый пузырек (ядро) ооцита мыши или в пронуклеус оплодотворенного яйца. Затем это яйцо имплантируется самке. Таким образом, были введены гены глобина и гибридные гены, содержащие промотор для металлотионеина, который сцеплен с кодирующей последовательностью тимидинкиназы. Промотор МТ ведет происхождение от природного гена мыши его присутствие можно определить по способности отвечать на обычную индукцию тяжелыми металлами или глюкокор-тикоидами (ответ определяют по активности тимидинкиназы). [c.501]

В слиянии пронуклеусов спермиев и яиц морского ежа участвуют центриоли, вносимые спермием [26] [c.51]

Рис. 16-28. Метод трансплантации нронуклеусов позволяет получать яйцеклетки, оба пронуклеуса которых принадлежат самцу (или самке).

Проблему мозаичности первичных трансгенных животных легко преодолеть, если использовать трансформированные и прошедшие селекцию ES-клетки в качестве доноров ядер. Пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки можно удалить, чтобы затем в эту яйцеклетку трансплантировать донорное яйцо, которое обычно берут из другого оплодотворенного яйца [9]. Ядра Е8-клеток, несущие трансгены, способны колонизировать эну-клеированные яйца, которые затем продолжат свое нормальное развитие. В результате может получиться животное, в каждой клетке которого будет содержаться трансген. [c.311]

Переместите яйцо в центр поля зрения. Подключите объектив 40XDI и сфокусируйте его на яйцеклетке. Перемещая фокальную плоскость вверх-вниз, локализуйте больший из двух пронуклеусов (обычно это мужской пронуклеус). Манипулируя шприцем Agia, поддерживающей пипеткой и инъекционной пипеткой, поверните яйцеклетки так, чтобы большой пронуклеус оказался по центру пипетки, но ближе к наружной стороне яйцеклетки (рис. 10.10,Л). Немного повысьте разрежение с помощью микрометрического шприца, чтобы яйцеклетка плотнее удерживалась микропипеткой. При этом оболочка яйцеклетки может деформироваться, но не допускайте, чтобы она сама вытягивалась в пипетку. [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология