Секвенирование прямое

Зная нуклеотидную последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секвенирования белка. Существует огромное количество компьютерных программ, позволяющих проводить компьютерный анализ полученных секвенирован-ных последовательностей, в том числе сравнение с известными последовательностями, определение степени гомологии, выявление специфических (например, регуляторных) последовательностей, возможность моделировать вторичные структуры РНК. [c.33]

Конечные нуклеотидные последовательности индивидуальных сегментов РНК вируса гриппа представляют значительный интерес из-за их общего включения в транскрипцию, трансляцию и репликацию. Ограниченное прямое секвенирование 5 - и З -концов 8 сегментов РНК вирусов гриппа А выявило присутствие общей последовательности из 13 нуклеотидов на 5 -копце у каждого сегмента и общую последовательность из 12 нуклеотидов на З -конце каждого сегмента [64, 218, 258] (для некоторых штаммов обнаружен Ц- или У-остаток в 4-м нуклеотиде на З -конце). Кроме того, [c.37]

Различные уровни защиты от действия РНКазы были обнаружены также и для представителей различных подтипов НА. Например, в то время как показатель этой защиты между генами НА большей части изученных подтипов составил 30%, для представителей подтипов НЗ (Гонконг) и Н7 (FPV) штаммов эта величина была равна 43% [111]. Это согласуется с эволюционным деревом различных НА вируса гриппа типа А, что было установи лено при прямом секвенировании РНК (см. ниже, рис. 18). [c.99]

Последние данные изучения структуры генов и генных продуктов вирусов гриппа, а также информация, полученная при использовании моноклональных антител, позволили получить несколько важных сведений о поведении этого вируса. Например, ясно, что антигенный шифт не происходит вследствие прямой мутации одного подтипа в другой, в то время как антигенный дрейф осуществляется в результате точечных мутаций в генах. Однако частота мутаций поверхностных белков не превышает существенно соответствующую величину для внутренних белков. НА имеет по крайней мере четыре различающихся антигенных сайта, которые могут варьировать независимо, с патогенностью, зависящей частично от последовательности в НА, где происходит расщепление. Некоторые сегменты РНК имеют перекрывающиеся гены, использующие две рамки считывания. Результаты секвенирования подтверждают антигенную классификацию подтипов НА и NA. [c.155]

Таким образом, с помощью данной конструкции можно проводить клонирование, секвенирование и экспрессию генов под контролем сильных промоторов, а также прямой отбор рекомбинантов и сайт-специфический мутагенез. [c.154]

Эта глава описывает ПЦР-амплификацию с использованием ДНК-полимеразы Taq и стратегию прямого секвенирования продуктов ПЦР-амплификации. [c.178]

Прямое секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК [c.184]

Прямое секвенирование имеет два важных преимущества перед традиционным клонированием фрагментов ПЦР в плаз-мидных и вирусных геномах. [c.184]

Данная стратегия с использованием ДНКазы I в сочетании с ПЦР привела к возможности нарабатывать матрицы для секвенирования прямо из трансформированных колоний, несущих делеционные варианты вставки, с последующим анализом амплификатов по размеру в агарозном геле [Burland, Kusukawa, 1997]. [c.250]

S РНК Е. oli была первой высокополимерной рибосомной РНК, полная первичная структура которой была установлена. Это было сделано как прямым химико-энзиматическим анализом нуклеотидной последовательности РНК в группе Ж. -П. Эбеля, так и путем секвенирования ДНК соответствующего клонированного гена в груп- [c.70]

Первичная структура рибосомной 23S РНК Е. соИ также была установлена как ее прямым химико-энзиматическим анализом, так и путем секвенирования ДНК ее клонированного гена (рис. 44). Одновременно и некоторое время спустя были секвенированы также высокополй-мерные РНК большой рибосомной субчастицы ряда других организмов, а также хлоропластов и митохондрий, которые дали материал Для сравнительно-эволюционного анализа. Весь арсенал методов, примененный в случае 16S РНК, был использован для изучения вторичной структуры 23 S РНК, и были найдены принципиально те же закономерности и особенности. Схема модели вторичной структуры 23S РНК Е. соН дана на рис. 45. Как и в 16S РНК, около половины или более остатков цепи 23S РНК оказываются вовлеченными в двойные спирали. Всего можно насчитать несколько более 100 индивидуальных спиралей. Наиболее ярким отличием от 16S РНК является, по-видимому, комплементарное спаривание 5 -конца 23S РНК с ее З -концом довольно стабильная совершенная двойная спираль из 8 пар нуклеотидов удерживает оба конца вместе, в значительной мере фиксируя общую свернутость цепи в конечную компактную структуру. Как и в 16S РНК, пары G U не редкость в спиралях 23S РНК. Кроме того, в спиралях имеются пары G А и, [c.77]

Проблема синтеза белка тесно связана с понятием генетического кода. Генетическая информация, закодированная в первичной структуре ДНК, еще в ядре переводится в нуклеотидную последовательность мРНК. Вопрос о том, каким образом эта информация передается на белковую молекулу, долго не был ясен. Первые указания на существование прямой линейной зависимости между структурой гена и его продуктом — белком можно найти у Ч. Яновского. В серии изящных опытов с применением методов генетического картирования и секвенирования он показал, что порядок изменений в структуре мутантного гена триптофансинтазы у Е. oli точно соответствует порядку изменений в аминокислотной последовательности молекулы белка-фермента. [c.520]

Метод ПЦР применяется также для выявления спонтанных мутаций, внесения специфических мутаций in vitro, сборки полноразмерных генов из синтетических олигонуклеотидов, секвенирования ДНК. Во многих случаях возникает необходимость в клонировании ПЦР-продук-та. Однако прямое клонирование с помощью лигирования по тупым концам затруднено, по- [c.97]

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу вьщеления исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом Р в 5 -конце с использованием [у - Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь звездочка обозначает радиоактивную метку Р на 5 -конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5 -конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З -кон-цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле бок о бок . Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5 -конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. [c.273]

Прямое секвенирование аминокислот более утомительно и неэкономично по сравнению с определением последовательности РНК. Однако при незнании N-терминальной и С-терминальной последовательности белка всегда имеется неопределенность относительно того, действительно ли первый стартовый кодон мРНК используется для инициации синтеза этого белка или первый стоп - [c.116]

До настоящего времени только два гликопротеида — НА и NA — были изучены прямым секвенированием аминокислот. Для НА. было обнаружено, что его синтез начинается с лидер-последовательности, поскольку первые 15—18 аминокислот, ожидаемые после первого стартового кодона мРНК, не присутствуют на N-конце НА1. Дальнейшие характеристики молекулы НА, обнаруженные методом прямого секвенирования, обсуждены выше [117]. [c.117]

Широкому применению метода расщепления по цистеину с целью получения крупных фрагментов препятствует то обстоятельство, что С-концевой фрагмент блокирован по аминогруппе остатком иминотиазолидина. Попытки деблокирования с помощью классического секвенирования по Эдману дали отрицательный результат [96]. Таким образом, полученные пептиды, за исключением N-концевого, не могут быть использованы для прямого секвенирования. Недавно предложен метод модификации указанных пептидов на никеле Ренея [133]. После обработки защищенных пептидов активным (нейтральным) катализатором W-6 в нейтральной среде при 50 °С в течение [c.121]

Еще одно неудобство, вызванное прямым секвенированием продуктов ПЦР, обусловлено способностью двух цепей амплифицированного фрагмента к быстрой реассоциации, что мешает отжигу секвенационного праймера на комплементарной последовательности или блокирует реакцию достройки комплекса затравка — матрица. Устранить это препятствие можно, применяя один из вариантов стандартного метода секвенирования двухцепочечной ДНК или модифицируя ПЦР с целью получения одноцепочечных продуктов. [c.185]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)—это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 раз [1, 2]. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР высокоэффективное клонирование геномных последовательностей [3], прямое секвенирование митохондриальной и геномной ДНК [5—7, см. ниже], анализ вариаций нуклеотидных последовательностей [8] и выявление вирусных патогенов [9—И]. [c.176]

Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности (специфичность праймера) и 2) способом получения образца, приемлемого для секвенирования. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод (Максама — Гилберта). Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть [12]. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель [15]. [c.185]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология