Электронная микроскопия, определение структуры белко

В отличие от статистического клубка, белковая глобула является не рыхлым флуктуирующим образованием, но компактной, плотно упакованной регулярной системой — апериодическим кристаллом. Плотная глобулярная структура белковой молекулы непосредственно доказывается малой вязкостью белков в растворе. Характеристическая вязкость [т ] (см. стр. 148) составляет для белков величину порядка сотых дециметра на 1 г (см., например, [78]). Определенный отсюда удельный объем много меньще, чем у обычных полимеров, образующих в растворе рыхлые клубки, и близок к удельному объему сухого белка. Это подтверждается всей совокупностью результатов исследования белков методами седиментации, диффузии, светорассеяния, рентгенографии, рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами, электронной микроскопии и т. д. [c.221]

Недавно сообщалось о некоторых особо ярких примерах того, как из белковых молекул могут самопроизвольно возникать некоторые общеизвестные типы биологических структур. Среди различных тканей организма хрящ и мышца отличаются особо сложным и правильным молекулярным строением. В электронном микроскопе на волокнах любой из этих тканей виден красивый рисунок, образуемый поперечными полосами различной ширины и контрастности, расположенными исключительно правильно. Белки, образующие эти структуры, можно перевести в раствор и перемешать их так, что все молекулы расположатся совершенно беспорядочно. Но если их затем в определенных условиях осадить, то молекулы снова определенным образом [c.27]

Даже если предположить, что белковая молекула представляет собой длинное, нитевидное образование (пространственная конфигурация которого может принимать самую причудливую форму), трудно себе представить какую-либо упорядоченность в белковой системе. Однако фотография кристаллического растительного белка, полученная с помощью электронного микроскопа (фиг. 81), дает основание полагать, что по крайней мере некоторые, а вероятно большинство белков, могут каким-то образом существовать в совершенно определенных конформациях, или формах. Именно вторичная структура белка дает возможность образовывать такие уникальные формы белковой молекулы. [c.314]

Поскольку при определении молекулярных масс белков ошибки могут достигать существенной величины, полученные данные следует оценивать с известной осторожностью. Важное значение имеет симметрия молекулы олигомера. Наиболее часто встречаются димерные и тетрамерные структуры, вместе с тем есть множество примеров гексамеров, октамеров и додекамеров. Известно всего несколько работ, где упоминается о существовании тримеров, пентамеров и гептамеров [63]. Таким образом, если расчеты показывают, что олигомер включает одиннадцать мономеров, вероятнее всего, мы имеем дело с артефактом. О структуре крупных олигомеров судят по данным рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии [13, 131]. [c.51]

Хотя повышение pH и ионной силы или присутствие липидов способствует агрегации всех глиадинов [10], образование фибрилл наблюдалось только у некоторых а-глиадинов. Ввиду этого возможно, что образование фибрилл вовлекает вторичные специфические взаимодействия, зависящие от конформации основных единиц [114]. Структура других глиадинов может препятствовать образованию фибрилл этого типа. К тому же иммунохими-ческое исследование глиадинов [28] показывает, что а-, р-, у- и ы-глиадины состоят из иммунологически различных белков, т. е. различных по своей третичной структуре. Различие антигенных структур недавно подтверждено методом ELISA [179]. Обнаружены различия в N-концевых последовательностях. Изучение структуры глиадинов с помощью трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии обнаруживает в них не определенную структуру, а аморфную совокупность [55, 142]. [c.198]

Определение четвертичной структуры белковых агрегатов возможно только с помощью высокоразрешающих физикохимических методов (рентгенография, электронная микроскопия), Четвер-Ййчная структура характерна лишь для некоторых белков, например гемоглобина, [c.373]

Для исследования надмолекулярной структуры высокомолекулярных соединений применяется также электронный микроскоп. Для препаратов природной целлюлозы, фибриллярных белков и коллагена можно по соответствующим снимкам этих препаратов или препаратов, напыленных металлом, сделать вывод о расположении молекул в более крупных образованиях. Электронно-микроскопические исследования дают ценные результаты и при изучении вирусов так, можно было установить, что вирус табачной мозаики в жизнеспособном состоянии состоит не из одной молекулы, а при изменении pH распадается на большое число маленьких однотипных частиц. Распад является обратимым, хотя при этом процессе происходит потеря вирусом функций жизнедеятельности и способности к размножению. Электронный микроскоп является прибором для определения размеров частиц, лежащих между молекулярными и оптически определимыми. Однако отдельные нитевидные молекулы не могут быть наблюдаемы в электронном микроскопе, так как их поперечный размер слишком мал. Однако Хуземан и Руске удалось наблюдать отдельные шарообразные макромолекулы п-йодбензоил-гликогена эти макромолекулы были предварительно охарактеризованы другими методами. [c.198]

Запасные вещества — продукты жизнедеятельности протопласта — могут откладываться в клетке в больших количествах в виде зерен крахмала, белка, капель масла и др. Электронный микроскоп позволил открыть чрезвычайно сложную высокоорганизованную субмикроскопическую молекулярную структуру клетки. Коллоид протоплазмы, мало прозрачный, казавшийся в световой микроскоп почти однородным, ожил в электронном микроскопе в протоплазме удалось обнаружить несколько пространственно организованных мембранных систем, системы ходов сообщений , связывающих ядро клетки, пачки многомембранных лакун, митохондрий и определенных участков цитоплазмы. В каждой живой клетке активно происходят сложные химические процессы, составляющие ее метаболизм, т. е. постоянные превращения и обмен веществ с другими клетками и с внешней средой. [c.14]

Физические и химические свойства белков, Р-ры Б. обладают рядом свойств, характерных для лиофильных коллоидных р-ров. Частицы Б. не проходят через полупроницаемые мембраны, что используется для их очистки от низко-молекулярных соединений диализом. Наличие на поверхности частиц Б. многочисленных полярных групп обусловливает их значительную гидратацию. Так, количество гидратационной воды, связанной с альбуминами и глобулинами, составляет 0,2—0,6 г на 1 г сухого веса Б. В определенных условиях Б. образуют гели (студни). Во многих случаях Б. удается получить в кристаллич. виде. Б. в р-рах седимен-тируют в ультрацентрифугах при ускорении порядка 200 000 константы седиментации (s) Б. находятся в пределах от l-10 i до lOO-lO i сек. Коэфф. диффузии Б. О,МО —10-10 см /сек средний удельный объем 0,75 см г. Эти физико-химич, характеристики используются для определения мол. веса Б., а также степени асимметрии их молекул е/а, где в и а — продольная и поперечная полуоси гидродинамически эквивалентного эллипсоида, приближенно принимаемого за форму молекулы Б. Мол. вес Б. — от 5000 до нескольких миллионов, в/а — от 1 до 200. Для определения мол. весов и размеров молекул Б. широко применяется метод светорассеяния. Мол. веса могут быт1> определены также методом осмометрии, методом исследования монослоев на поверхности жидкой среды. Размеры молекул Б. определяются методом двойного лучепреломления в потоке, измерением коэфф. вращательной диффузии. Макромолекулы некоторых Б. наблюдались в электронном микроскопе. Для изучения структуры Б. широко применяется метод рентгеноструктурного анализа и электронографии. [c.193]

Исследование тонкой структуры таких пуффов под электронным микроскопом показало, что их характерный вид обусловлен локальным распрямлением тысячи параллельных плотно закрученных двойных спиралей ДНК, покрытых белком, из которых построена гигантская хромосома. Каждая из этих нитей имеет вид стержня фибриллярных участков матрикса, напоминающего картину ядрышковой транскрипции в ооцитах, показанную на фиг. 249. Таким образом, пуфф является видимым проявлением активной транскрипции определенной группы генов, находящихся в соответствующем участке хромосомы. Следовательно, регистрируя расположение пуффов на гигантской хромосоме IV в слюнных железах хирономуса на разных этапах превращения личинки во взрослое насекомое, можно-изучить динамику дифференцированного выражения генов. Результат такой работы схематически изображен на фиг. 253, которая показывает наличие или отсутствие пуффов в четырех определенных участках хромосомы IV на последовательных стадиях метаморфоза. Как видно, пуффы в точках А к Б появляются и исчезают дважды за период наблюдения, причем фазы их появления противоположны. Пуффы в точках В к Г появляются лишь к концу периода наблюдения. [c.516]

Миозин является объектом всестороннего изучения практически на протяжении всего XX столетия. Еще в исследованиях А.Я. Данилевского в конце прошлого века отмечалось, что миозин обладает двойным лучепреломлением. Однако до самого последнего времени все знания о пространственной структуре ограничивались информацией о внешнем очертании молекулы и ее габаритных размерах, полученных с помощью электронной микроскопии. В частности, было известно, что миозиновая головка имеет грушевидную форму 190 A в длину и 50 A в ширину, а двойная спираль хвостового участка соответственно 1500 и 20 А [468-471]. Последние три десятилетия камнем преткновения в определении трехмерной структуры миозина, как и структуры актина, было получение качественных кристаллов белка для рентгеноструктурного анализа. И. Рейменту и соавт. удалось получить требуемые кристаллы, использовав не совсем обычный в белковой кристаллографии прием - N-метилирование боковых цепей всех остатков Lys миозинового фрагмента I в мягких условиях [472]. Для того чтобы убедиться в том, что метилирование не привело к радикальному изменению конформационных и ферментативных свойств белка, авторы подвергли подобной химической модификации лизоцим и не обнаружили после этой процедуры существенных нарушений в трехмерной структуре фермента. Кроме того, были проверены кинетические свойства метилированного миозина SI [473]. Он сохранял каталитическую активность, хотя и наблюдались отклоне- [c.125]

Специфическим свойством эволюционно отобранной аминокислотной последовательности является способность принимать в физиологических условиях вполне определенную, уникальную конформацию, которая определяет биологическую функцию белка. Такой способностью белки обладают, несмотря на значительную конформационную свободу аминокислотных остатков и малые значения барьеров вращения вокруг ординарных связей основной и боковых цепей. Плотная, глобулярная структура белковой молекулы непосредственно доказывается малой вязкостью белков в растворе и большей их плотностью по сравнению с синтетическими полипептидами. Молекулы последних образуют в тех же условиях рыхлые клубки с открытой структурой, в которых растворитель занимает до 99% всего объема. Отсюда сравнительно большие линейные размеры клубков и значительная вязкость белков в этом состоянии. Молекулы нативных белков содержат в несколько раз меньшее количество связанной воды (-30% по массе), они малы по линейным размерам и незначительно загущают раствор. На это указывает вся совокупность результатов исследования белка и синтетических полипептидов методами седиментации, диффузии, светорассеяния, рентгеноструктурного анализа, нейтронографии, рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами, электронной микроскопии. [c.231]

Классической работой по электрофоретическому разделению белков мембран эритроцитов человека является исследование Фейрбанкса и соавт. (1971), в котором предложена номенклатура полипептидных полос, выявляемых в солюбилизированной с помощью додецилсульфата натрия (ДСН) мембране. Этой номенклатурой пользуется в настоящее время большинство ученых. Наличие сетчатой структуры, выстилающей внутреннюю поверхность мембраны эритроцита, было обнаружено непосредственно с помощью электронной микроскопии после обработки клеток неионным детергентом тритоном Х-100. При определенных экспериментальных условиях (в среде с высокой ионной силой и при низкой температуре) применение этого детергента позволяет полностью солюбилизировать липидный бислой и интегральные белки. При этом остается сеть белков, сохраняющая исходную форму клетки, которая представляет собой мембранный скелет (каркас) эритроцита. Он тестируется в виде двухмерной сети филаментов, длина которых зависит от особенностей приготовления препарата для микроскопии. Необходимо отметить, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроцитов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. В связи с универсальностью данной системы следует более подробно рассмотреть структуру и свойства некоторых цитоскелетных белков. [c.31]

Яйцо покрыто защитной оболочкой у птиц — неорганической скорлупой, у амфибий — студенистой оболочкой, в состав которой входят полисахариды и высокомолекулярные белки. У млекопитающих поверхность яйца докрыта одним слоем очень мелких клеток. Собственно яйцо, т. е. цитоплазму с находящимся в ней единственным гаплоидным ядром, окружают одна или несколько мембран. Цитоплазматические структуры яйца, тонкое строение которых исследовали с помощью электронного микроскопа, по-ви-димому, не отличаются от структур других типов клеток. И наконец, в яйцах находится желток, служащий запасом пищи для зародыша. Это гетерогенная смесь жировых капель, гранул и небольших, окруженных мембраной телец. Некоторые из них сйльно пигментированы. Желток имеет свою внутреннюю организацию, он занимает определенные районы яйца и распределяется между дочерними клетками вполне определенным образом. [c.162]

По данным поляризационной и электронной микроскопии четырехокись осмия обеспечивает хорошую сохранность субмикроскопических структур клетки. Щадящая фиксация объясняется главным образом воздействием на белки, которые не коагулируют, а желатинизируются. При этом определенную роль играет и эффект образования сшивок. Минимальное возд ствие четырехокиси осмия на структуру по сравнению с другими фиксирующими веществами (юъясняется процессом желатинизации, который практически не сопровождается сморщиванием ткани. Четырехокись осмия реагирует с белками или их аминокислотными группами и, что особенно характерно, с липидами. Различные реакции четырехокиси осмия с активными группами различных аминокислот перечислены в табл. 5. [c.39]

Не вызывает сомнения, что регуляция активности фермента тесно связана с пространственной организацией молекулы белка. В связи с этим безусловный интерес представляют результаты, полученные методом поперечной сшивки с помощью диметилсубе-римидата [122, 123] и электронномикроскопические исследования [124]. Сшивающий агент может взаимодействовать с компонентами комплекса, расположенными на достаточно близком расстоянии друг от друга. Так, например, полученный после сшивки полипептид с м. в. 60 000 [122] был расшифрован как комплекс, состоящий из двух субъединиц — у6. Исследуя субъединичную структуру сшитых комплексов на основе их чувствительности к действию определенных протеиназ, можно было предположить, что полученные сочетания субъединиц — у8. Руг, аР, аа — обусловлены более тесным контактом их в пространственной организации молекулы. Исследование КФ методом электронной микроскопии показало, что молекула имеет форму буквы Н она представляет собой структуру, состоящую из двух больших доменов, соединенных уз- ким мостиком. Каждый домен разделен на две половины, и мостик находится около участка их соединения. Размеры больших частей позволяют предположить наличие 2а- и 2р-субъединиц в каждой части. Мостик, соединяющий эти части, может включать в себя у-субъединицы. На основе данных электронной микроскопии и результатов, полученных при сшивании субъединиц, была предложена гипотетическая схема строения КФ, согласно которой 2а- и 2р-субъединицы находятся в множественных контактах, а мостик, состоящий из 4 у-субъединиц, расположен таким образом, что р-субъединица одновременно может контактировать с 2у-субъеди-ницами [123, 124]. [c.64]

Электронная микроскопия — удобный метод анализа четвертичной структуры белков, особенно крупных молекул со многими субъединицами. Главное ограничение метода, с одной стороны, сравнительная прозрачность белков по отношению к пучку электронов, а с другой — их недостаточная стабильность в условиях бомбардировки электронами и глубокого вакуума. Однако, несмотря на это, обычно удается проводить структурный анализ с разрешением до 2 нм, а при соблюдении определенных предосторожностей— до 1 нм. На рис. 6.16 изображены электронные микрофотографии (электронограммы) фермента аспартат-транскарбамоилазы Е. oli, состоящей из 12 субъединиц, 6 из которых имеют молекулярную массу 17 000 (R-субъединицы), а 6 других — 33 500 (С-субъединицы). Необходимо отметить, что тримеры С-субъеди-ниц также проявляют ферментативную активность и в комбинации с димерами R-субъединиц образуют молекулу с субъединичной структурой (R2)3( 3b (разд. 8.7.1). Исходя из этих данных, а так- [c.199]

Выявление трехмерной структуры миоглобина Джоном Кендрью ]. Кепс1ге у) и гемоглобина Максом Перутцом (М. Реги1г) явилось выдающимся достижением молекулярной биологии. Эти исследования, успешно завершенные в конце 50-х годов, доказали применимость рентгеноструктурного анализа (рентгеноструктурной кристаллографии) для изучения структуры таких макромолекул, как белки. До 1957 г. самой большой из исследованных этим методом молекул был витамин В з, молекулярная масса которого на порядок меньше молекулярной массы миоглобина (17,8 кДа) или гемоглобина (66 кДа). Определение пространственной структуры этих белков послужило огромным стимулом для развития белковой кристаллографии. Проводятся исследования по установлению пространственной структуры большого множества различных белков. Более чем для 50 белков пространственная структура к настоящему времени изучена уже детально. Рентгеноструктурный анализ вносит большой вклад в наши представления о структуре и функции белков, потому что это единственный метод, выявляющий пространственное расположение большинства атомов в белке. Ценным источником информации о структуре биологических макромолекул может служить также электронная микроскопия, однако пока еще она не позволяет выявить [c.50]

Пуриновые и пиримидиновые основания интенсивно поглош,ают свет в УФ-области спектра благодаря наличию тг-электронного сопряжения. Максимум поглощения лежит около 260 нм (для сравнения у белков — около 280 нм). Положение максимума поглощения зависит от химического строения гетероцикла, т. е. от природы заместителей в гетероциклическом ядре. Важно отметить, что максимум поглощения незначительно зависит от структуры углеводного остатка, поэтому спектроскопические свойства азотистых оснований с успехом используются для количественного определения нуклеиновых кислот в растворах и биосредах, для ультрафиолетовой микроскопии живых тканей и для выявления мутагенных эффектов при УФ-облучении. [c.268]