Моноклональные антитела очистка

В разделе изложены методы иммунизации животных и гибридизации клеток для получения поликлональных и моноклональных антител, методы получения препаративных количеств антител и их очистки, способы введения ферментных меток в антитела и антигены для использования в иммуноферментном анализе, способы введения радио-изотопных меток в антитела для радиоиммунного анализа, методы изучения антигенных свойств ферментов [c.307]

Очистка моноклональных антител [c.315]

Для очистки больших количеств моноклональных антител из асцитных жидкостей применяют хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.316]

В клетке можно пометить любые молекулы для этого е них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. [c.228]

ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ [c.37]

Получ ни и очистка моноклональных антител [c.43]

В заключение отметим, что получение и очистка моноклональных антител требуют новых как научных, так и инженерных разработок, чтобы можно было проектировать процессы, обеспечивающие как быстрый рост продуцирующих клеток (т.е. гибридом), так и высокое качество конечного продукта. Создание таких процессов позволит получать большие количества моноклональных антител (до 100 г в одном периодическом процессе) с очень высокой степенью чистоты. Ясно, что такие процессы являются идеальными для получения новых моноклональных антител, которые могут быть применены в иммуноанализе. [c.50]

IV. Антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и крысы. Для общих целей анти-IgG, получают путем иммунизации животных фракцией IgG, полученной в результате аффинной очистки на колонке с протеинА-сефарозой (разд. 10.6.1). Для удаления антител к другим классам иммуноглобулинов сыворотки сорбируют моноклональными антителами или сывороткой, лишенной IgG. [c.104]

Проблема получения специфических антител при отсутствии чистого антигена была решена с разработкой технологии получения моноклональных антител (МКА) [9], позволяющей выделять антитела к индивидуальным компонентам любой сложной смеси антигенов [10]. Очень скоро МКА были использованы в аффинной хроматографии — вначале для очистки антигенов клеточной поверхности [И, 12], а затем для выделения множества других белков [13, 14]. [c.165]

Потенциальная контаминация названных выше продуктов возможна из рааллчных источников от лиц, чьи клетки используются в биотехнологических процессах, от миеломных клеток, применяемых для получения гибридов, из питательных сред для культивирования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для очистки белковых продуктов, например, моноклональные антитела, наконец, несоблюдение требований GMP [c.256]

Рис. 159. Схема очистки рекомбинантного интерферо-Е1а с помощью моноклональных антител (МкАТ) 1 - диализат с интерфероном и другими бактериальными белками, 2 - интерферон, 3 - балластные белки, 4 - МкАТ, 5 -интерферон, связывавший с МкАТ, 6 - слабая кислота.

Применение моноклональных антител. Практическое использование МкАТ исключительно многообразное — в медицине И ветеринарии (в целях диагностики, терапии), в биотехнологии для получения, выделения и очистки специфических продуктов, в исследованиях фундаментальных и прикладных проблем. Так, например, стволовые клетки костного мозга не обладают какими- [c.579]

Область возможного применения моноклональных антител весьма обширна. Их используют в диагностике, например для быстрого и точного типирования тканей и органов, предназначенных для пересадки. Они находят применение при очистке белков и других биологических соединений методом иммуноад- [c.313]

Примером использования моноклональных антител для очистки и крупномасштабного производства важных для медицины веществ может быть работа Секера и Берке (Se her, Burke,. [c.334]

Клонирование фрагментов генома, содержащих ОРС, в экспрессирующих векторах позволяет нарабатывать для иммунизации большие количества чистого белка. Это делает получение моноклональных антител к белкам, кодируемым последовательностями ОРС, стратегически простой, хотя и в некоторой степени трудоемкой задачей. Основные требования при подобной работе— наличие хорошей культуры клеток и использование высокочувствительного метода анализа, позволяющего отличать антитела к продуктам ОРС от антител, узнающих векторные фрагменты гибридного белка. Отлаживание такого метода— основное узкое место рассматриваемого подхода. После получения специфических моноклональных антител к продукту, кодируемому встроенным фрагментом, их можно использовать для выявления, количественного анализа и очистки белкового продукта ОРС. [c.180]

При обычных методах культивирования концентрация антител в культуральной жидкости лежит в пределах 10—100 мкг/мл. Более высокие концентрации удается получить в ферментерах при использовании сред с низким содержанием СПК и добавлением определенных препаратов [препараты приматон КГ и плу-роник Р-68 (5. Кеиуепу е а1., 1986)] —до 660 мкг/мл. Важным направлением исследований является подбор бессывороточных сред, применение которых значительно облегчает последующие этапы очистки моноклональных антител. [c.117]

Применение моноклональных антител для иммуноанализа пептидов требует большой осторожности, поскольку высокоспецифичные моноклональные антитела могут взаимодействовать, например, только с одним из изогормонов. По этим же причинам нельзя использовать слишком специфичные моноклональные антитела и для аффинной очистки пептидов. Кроме того, существует опасность разрушения образца при его элюировании с аффинной колонки под действием pH и ионной с ы раствора. И наконец, следовые количества антител могут загрязнять очищенный продукт и влиять на результаты анализа. [c.35]

Использование мшроироцессоров. На неавтоматизированных предприятиях большую часть затрат на производство моноклональных антител составляют расходы на оплату труда. Поэтому ручной труд целесообразно автоматизировать. В нашем случае всем процессом можно управлять с помощью компьютера, который обеспечивает автоматическое включение и выключение необходимых клапанов и насосов на всех этапах процесса, в том числе на стадиях очистки, стерилизации, проведения основного процесса, сбора клеток и выделешш антител. В этом случае функции оператора ограничиваются только приготовлением питательной среды и общим наблюдением за ходом процесса. Однако осуществление высокой степени автоматизации невозможно без активного компьютерного самоконтроля, а также без проверки правильности выполнения всех технологических стадий. Кроме того, компьютер должен сигнализировать об авариях и принимать необходимые меры в случае отказа той или иной основной или вспомогательной системы. [c.41]

СО свойствами гибридомных клеток. Рассмотрим характерные особенности ферментеров и процесса, применяемых для получения и очистки моноклональных антител на фирме ellte h. [c.45]

Выделенне антител. По завершении ферментации получают раствор, содержащий активные растворенные моноклональные антитела, отработанную питательную среду, цельные клетки и большое количество продуктов их деградации. При очистке антител сначала удаляют твердые примеси. Для этой, цели культуральную жидкость или фильтруют (до 100 л в одной операции), или, чаще, подвергают непрерывному проточному центрифугированию. Эффективность последнего процесса может быть существенно повышена за счет использования агентов, ускоряющих флокуляцию клеток и их фрагментов. В этом отношении наиболее эффективной оказалась полигалактуроновая кислота [37 ]. [c.46]

В зависимости от области применения антител и от их свойств можно использовать самые различные способы очистки. Для диагностических целей часто достаточно имет препараты антител 70-95%-ной степени чистоты. С другой стороны, при применении антител in vivo их чистота должна быть намного выше. В сывороточных средах содержание антител не превышает 10% от общего количества белка. Хотя проведение процесса на бессывороточных средах и облегчает очистку, на практике относительно легко достичь 90%-ной и даже более высокой степени чистоты независимо от содержания сывороточных белков. При очистке антител для их использования ш vivo на последних стадиях очистки приходится решать одни и те же проблемы независимо от природ и питательной среды. Высокоэффективные методы очистки необходимы для удаления следовых количеств не только примесных белков, но и пирогенов и ДНК. Ранее для очистки антител широко применяли фракционирование сульфатом аммония с послед)пющей ионообменной хроматографией. Применение этих методов осложняется тем, что различные моноклональные антитела имеют разные изо-электрические точки [34, 36 J. Кроме того, после ионообменной хроматографии чистота антител не превышает 90%, поэтому для дальнейшей очистки необходимы другие методы, например гель-фильтрация. Однако в тех случаях, когда моноклональные антитела использ)пют для диагностики или иммуноаффинной очистки, ионообменная хроматография или ее сочетание с предварительным осаждением позволяют получить препараты достаточного качества. [c.47]

Использование микрокомпьютерной системы управления позволяет совершенствовать метод аффинной хроматохрафии. Свойства аффинных колонок после каждого цикла меняются, как бы точно ни выполнялись условия очистки. Поэтому система управления, основанная на регистрации времени или объема, не может реагировать на такие изменения. Высокая стоимость аффинных колонок, особенно белка А, а также ценность получаемых моноклональных антител требуют включения в систему управления приборов, реагир)пющйх на любые отклонения и неполадки. Например, применение датчиков на воздух позволяет предотвратить высушивание колонки при прекращении подачи раствора, а использование клапанов давления перед входными фильтрами предотвращает разрушение системы, если колонка забьется. [c.49]

Для дальнейшего совершенствования процесюв получения и очистки моноклональных антител необходимо провести исследования в нескольких направлениях. Используемые в настоящее время процессы ферментации очень эффективны. Однако более глубокое понимание физиологии гибридом и линий клеток человека должно позволить увеличить выход продукта. Например, очень перспективным представляется улучшение линий клеток путем повторного [c.49]

Выше обращали внимание на необходимость тщательной проверки чистоты препаратов клеточных рецепторов, выявление в изучаемом препарате примеси клеточных ферментов. Так, нанрп-мер, было установлено присутствие в препаратах рецептора гормона роста фермента — фосфотидилннозиткиназы. Последняя выделяется вместе с рецептором даже при иснользовании для его очистки методов аффинной хроматографии на иммобилизованном гормоне или иммобилизованных моноклональных антителах против рецептора (D. М. Thompson et al., 1985). Несмотря на эти факты, существуют веские основания утверждать, что у рецептора гормона роста имеется собственная ферментативная активность, в том числе эндонуклеазная. Об этом свидетельствуют следующие наблюдения. [c.31]

Большое разнообразие макромолекул, изучаемых с помощью антител, включает не только естественные продукты животных н растений, но, и продукты микробного происхождения, и синтетические вещества. Приготовление поликлональной антисыворотки к определенным молекулам может включать предварительную очистку, если нельзя получить очищенный коммерческий препарат. Для компонентов клеточной поверхности современный подход — это получение моноклональных антител требуемой специфичности при этом решается проблема очистки иммуногена (см. гл. 3). С другой стороны, с помощью уже существующих антител можно очистить компоненты клеточной поверхности, а также проводить обогащение клеток, экспрессирующих антиген-мишень. Эти подходы обсуждены в гл. 5. Метод экстракции имеет большое значение в тех случаях, когда необходимо получить полиспецифическую антисыворотку к смеси иммуногенов, например экстрагированных клеточных мембран, гомогенатов тканей, разрушенных ультразвуком бактерий, вирусов и паразитов. Невозможно в этой главе привести детальное руководство по экстракции и очистке огромного разнообразия иммуногенов. Существует специальная литература, посвященная методам получения углеводных, бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных антигенов [21]. Очистка с помощью аффинной хроматографии описана в гл. 5, а приготовление иммуноглобулинов [c.50]

До начала использования моноклональных антител разделение подклассов IgG иезависимо от требуемой степени чистоты оставалось трудной задачей. Методика очистки заключается в следующем [11] [c.109]

Доступность моноклональных антител в достаточно больших количествах позволяет использовать другой метод очистки подклассов IgG (так же как IgM, IgA и, IgE)—аффинную хроматографию на колонках с иммуносорбенто м. Процедуры аффинного связывания и элюции рассмотрены в гл. 5. [c.110]

Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]