Триптические пептиды, разделение

Фиг. 42. Разделение пептидов из триптического гидролизата глобина [35].

Разделение триптических пептидов [59] [c.215]

Теперь необходимо произвести полное разделение всех пептидов и получить каждый из них в чистом виде. Снова применяется хроматография на ионообменной смоле, на этот раз с слабокислотными, т. е. карбоксильными группами. Часть пептидов в триптическом гидролизате короткие — ди- и трипептиды. (Аминокислот трипсин не дает совершенно, так как это так называемая эндопептидаза, рвущая пептидную связь только, если рядом расположена другая пептидная связь, т. е. внутри цепочки. Все старые работы, в которых измерялось выделение аминокислот под действием трипсина, имели дело с грязной ферментной смесью). Но в гидролизате присутствуют и довольно длинные фрагменты, состоящие из 20—30 аминокислотных остатков. Все определяется расстановкой диаминокислот вдоль цени белка. [c.25]

Поскольку в аР-половине гемоглобина содержится в общей сложности 27 остатков лизина и аргина, при триптическом гидролизе образовалось 28 разных пептидов. Следующий этап состоял в разделении полученных пептидов. Для этого был применен метод двумерного разделения (рис. 5.6). Смесь пептидов наносили в виде небольшого пятна в угол большого листа фильтровальной бумаги. Далее проводили электрофорез в одном направлении, разделяя таким образом пептиды в соответствии с их общим зарядом. Однако полного разделения [c.92]

Сильноосновные пептиды, в частности содержащие остатки аргинина, можно фракционировать при pH > 7, т. е. в той области, где карбоксильная группа ионита диссоциирует полностью. В качестве примера на рис. 34.13 приведено разделение триптических пептидов клупеина. Анализ показал, что многие из 16 полученных фракций негомогенны. Так, фракции 2—7, 9—12 и 14 содержат пептиды с одним, двумя и тремя остатками [c.410]

Триптические пептиды а-и р-цепей гемоглобина хроматографировали в градиенте пиридин-ацетатных буферов [39]. При этом хроматографическое поведение пептидов в целом напоминало их поведение при разделении на смоле дауэкс-50, хотя в профилях элюирования наблюдались несомненные различия. Поэтому те пептиды, которые элюируются на смоле дауэкс-50 в одной зоне, можно разделить на фосфоцеллюлозе, и наоборот. На основании этой работы можно сделать определенные выводы относительно связи между хроматографическим поведением и структурой пептидов. За редким исключением, более длинные, отрицательно заряженные пептиды элюируются в меньшем объеме по сравнению с короткими, положительно заряженными пептидами. Пептиды, содержащие более шести аминокислотных остатков и несущие слабый отрицательный заряд (—2), элюируются при рН<4,7 короткие пептиды, включающие менее семи остатков и в целом заряженные положительно, элюируются при рн > 4,7. В работах [38, 39] отмечено также удерживание фосфоцеллюлозой гистидинсодержащих пептидов. [c.412]

Рис. 10. Кривая разделения растворимых триптических пептидов, полученных из 10 мг гемоглооина, на колонке

Таблица 7.1. Условкя двумерного разделения триптических пептидов на пластинках с тонким слоем силикагеля

РИС. 7.3. Разделение триптических пептидов актинов моллюска и кролика на пластинках с тонким слоем силикагеля G. Триптические пептиды актинов моллюска (а) и кролика (б) стрелками отмечены уникальные пептиды электрофорез, pH 3,5 хроматография хлороформ — метанол — аммиак (2 2 1) в и г — триптические пептиды актинов моллюска (е) и кролика (г) стрелками отмечены уникальные пептиды, стрелкой со звездочкой — различие в положении пятен электрофорез, pH 6,5 хроматография пропанол — аммиак (7 3). д — гидролизат актина кролика, протеолиз и картирование в присутствии ДСН е — тот же гидролизат в обычных условиях некоторые пятна (обведены кружком) менее интенсивны в присутствии ДСН, в то же время другие (стрелки) более отчетливы электрофорез, pH 3,5 хроматография пропанол — аммиак (7 3). Все образцы нанесены в количестве 1 нмоль в 2,5 мкл (табл. 7.1) [60]. (С разрешения A ademi Press.) [c.236]

В текущей литературе очень часто встречаются описания двумерного разделения пептидов (например, триптических гидролизатов белка) на пластинках микрогранулированной целлюлозы, где в первом направлении проводится электрофорез в кислой среде, а во [c.485]

Рис. 34.12. Профиль элюирования пептидов триптического гидролизата к-типа белка Бенс-Джонса Ag (первая фракция после разделения на амберлите ШС-50, см. рис. 34.11) на колонке (1,8X150 см) со смолой дауэкс 50-Х2 в пиридин-ацетатных буферах [34].

Что касается пептидов, то из входящих в их состав аминокислот наибольшее сродство к гелям сефадекса придает им триптофан. Триптофансодержащие пептиды из частичных (например, триптических) гидролизатов белков (например, цитохрома с-551 из Pseudomonas) всего сильнее удерживаются гелем и элюируются в виде отдельной зоны [123]. Классическим примером подобного явления служит разделение тироцидинов. Эта группа циклических декапептидов, обладающих антибиотической активностью, состоит из трех компонентов, один из которых (тиро- [c.191]

Нин е мы остановимся на одной из последних работ Шредера [42] по ионообменной хроматографии пептидов, представляющей большой интерес как с хроматографической точки зрения, так и по методике детектирования элюатов. В указанной работе производилось разделение триптических гидролизатов а, р и у цепей человеческого гемоглобина путем последовательной хроматографии па катионите Дауэкс 50X2 и анионите Дауэкс 1X2. [c.170]

Результаты разделения на катионите Дауэкс 50X2 пептидов, полученных при триптическом гидролизе утробного человеческого гемоглобина состоящего из цепей а и "с, приведены на рис. 16 и в табл. 6. Там же указаны идентификация пептидов и их заряд при нейтральном pH, который определялся по Ин- [c.172]

Таблица 6 Идентификация пептидов триптического гидролизата человеческого гемоглобина Гл, разделенных на колонке со смолой Дауэкс 50X2

Электрофорез производился на установке, изображенной на рис. 20. Тонкослойная пластинка помещалась на охлаждаемый столик, который также использовался в качестве подставки при проточной хроматографии. Электрофоретическое разделение производили при напряжении 950—1000 в и силе тока 30 ма. Для по.чучения пептидной карты па пластинку размером 20x20 см наносили 0,5—0,05 мг пептидной смеси. Авторы работы [40] указыва-приготовить 8 пептидных карт. На рис. 21 представлена пептидная карта триптического гидролизата миозина. Детектирование пептидных пятен производилось с помощью нингидринового или хлортолидинового реактивов. Весьма перспективно детектирование пептидов на пластинке с помощью реакции динитрофенилирования в модификации Патаки [41] [c.318]

Стрелка Е указывает первое направление электрофоретического разделения, стрелка СН направление восходящей хроматографии, 5,—5 —точки нанесения образцов с добавкой индикатора мано(динитрофеиил)этилендиамина. После электрофореза и высушивания бумагу разрезают по линиям о, а после хроматографии по линиям Ь. Положение индикатора после электрофореза указано буквой с, после хроматографии индикатор сдвигается 8 точку 1. Квадрат с образцом — это Зг-пептидная карта фракции пептидов триптического гидролизата альбумина, модифицированного малеиновой кислотой, после обнару-жшня нингидрином. Условия разделения приведены в тексте. [c.333]

Фракционирование пептидов на ионообменных смолах основано на целом ряде принципов, о которых уже говорилось выше (гл. I и II). Сюда входят и различия в электрохимических свойствах разделяемых фрагментов, и различное сродство неполярных радикалов к бензольным кольцам матрицы смолы, и изменение концентрации конкурирующих ионов в буферном растворе. Поэтому элюция пептидов со смолы достигается путем пропускания через колонку буферных растворов изменяющейся ионной силы и pH. Это изменение концентрации ионов и pH может осуществляться линейно или ступенчато. Элюируемые компоненты идентифицируют нингидриновой колориметрией, лиофилизуют (высушивают из замороженного состояния) и проверяют на гомогенность с помощью хроматографии на бумаге и методом пептидных карт. Негомогенные пики фракционируют дополнительно. В качестве примера можно привести разделение пептидов, полученных триптическим гидролизом окисленной (т. е. лишенной дисульфидных мостиков) рибонуклеазы (рис. 11). [c.84]

Рис. и. Разделение пептидов триптического гидролизата окисленной рибонуклеазы на колонке с катионообменкиком Дауэкс 50-Х2 (из Гарриса и Ингрема, 1963) [c.85]

Щелочной гидролиз можно провод11ть с 2,5 и. раствором NaOH в течение 2,5 час с последующей нейтрализацией содержимого пробирок (из стекла, устойчивого к щелочи) водным раствором уксусной кислоты (1 1). На фиг. 39 и 40 показано разделение пептидов из 20-часового триптического гидролизата и из 24-часового химотриптического гидролизата окисленной рибонуклеазы. О степени чистоты элюированных пептидов можно судить по их аминокислотному составу. Для чистых пептидов можно ожидать целочисленных молярных отношений. Если данные анализа указывают, что исследуемый образец представляет собой смесь пептидов, то, изменяя условия pH и температуры, иногда можно провести дальнейшее фракционирование. [c.90]

Поэтому после окончания разделения мы, не проявляя пятен, подвергаем их хроматографии в перпендикулярном направлении. Для этого картонный лист высушивается, и его край погружается в ванночку с элюирующей жидкостью (5 объемов нормального бутанола, 2 объема ледяной уксусной кислоты и 2 объема воды pH этой смеси близок к 3 смесь необходимо выдержать 2 недели, чтобы образовалось равновесное количество эфира). По мере движения элюирующей жидкости вдоль листа, на что (при размере листа 80x80 см) требуется около суток, происходит дополнительное разделение каждого электрофоретического пятна на несколько пятен. Хроматография на бумаге производит разделение не по различию зарядов, а по сродству пептидов к органическому растворителю. Те из них, которые лучше растворяются в смеси бутанол—уксусная кислота, бегут быстрее вместе с движением растворителя, т. е. имеют большие Rf. В итоге получается полное разделение триптического гидролизата на отдельные пептиды. [c.26]

ТФУ и ГФМК используются в анализе аминокислотной последовательности по Эдману и доступны в высокоочищенном состоянии. Буферы на основе этих кислот летучи и прозрачны при 215 нм. Описано применение ТФУ и ГФМК для разделения пептидов [1, 30]. Эти кислоты идеальны как растворители для выделения пептидов типичным примером служит фракционирование триптического гидролизата цитохрома с на колонке с сорбентом Vyda С18 в градиенте концентрации ацетонитрила (рис. 6.10). [c.217]

До настоящего времени предложено несколько методов пептидного картирования. С-концевой пептид у-цепи фетального гемоглобина идентифицировали, сравнивая электрофореграммы триптических гидролизатов после повторного разделения (pH 6,5) в направлении, перпендикулярном первому, до и после удаления С-копцевых остатков Arg или Lys при помощи карбоксипептидазы В прямо на листе бумаги [63]. Теоретически после обработки карбоксипептидазой на диагонали должен быть только С-концевой пептид. Однако в случае у-цепи гемоглобина человека па диагонали оказались 3 пятна, а именно свободный Lys, дипептид Val-Lys (так как дипептиды очень медленно расщепляются карбоксипептидазой [46]) и ожидае- [c.484]

Для обнаружения С-концевой области А-белка бактериальной триптофансинтетазы сравнивали карты трипсинолиза белка до и после обработки его смесью карбоксипептидаз А и В [15]. С-Концевая последовательность этого белка имеет состав А1а-Ala-Thr-Arg-Ser, и при частичном триптическом гидролизе на пептидной карте обнаруживаются три пятна, соответствующие Ala-Ala-Thr-Arg-Ser, Ala-Ala-Thr-Arg и свободному Ser. После обработки карбоксипептидазами исчезает только пятно Ala-Ala-Thr-Arg, потому что второй пептид и свободный Ser мигрируют на хроматограмме, сливаясь с другими пятнами. Успешное использование этого метода сильно зависит от полноты разделения пептидов на хроматограмме. Чем крупнее молекула белка, тем больше вероятность того, что будет потерян С-концевой пептид. [c.485]

Для вирусов с хорошо установленным элементарным химическим составом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяют обнаруншть примеси, содержащие азот или фосфор, если они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоятельствах могут быть применепы также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющий обнаружить всего-навсего одну аминокислоту. Можпо также использовать метод отпечатков пальцев для разделения пептидов триптического гидролизата хорошо охарактеризованных вирусных белков, но чувствительность его как критерия чистоты также невысока. [c.48]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология