ДНС-аминокислоты, идентификация методом электрофореза

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Второй раздел практикума ставит своей целью познакомить студентов с особенностями выделения, фракционирования, идентификации и количественного определения различных природных азотсодержащих < оединений. белков, пептидов, аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеотидов и пр Предлагаемые экспериментальные работы включают аиболее широко используемые в лабораторной практике современные методы разделения и анализа этих соединений различные виды электрофореза, хроматографии, спектрофотометрии, колориметрии и др. Работа проводится как на готовых коммерческих препаратах высоко- и низкомолекулярных азотсодержащих соединений, так и на препаратах, выделяемых студентами из различных тканей лабораторных животных. [c.79]

Под действием электрического тока они мигрируют к аноду или к катоду в зависимости от pH среды. Если этот процесс проводят на хроматографической бумаге или в гелях, то он называется электрофорезом. Этот метод часто применяют для идентификации и разделения аминокислот. [c.491]

В пятидесятых годах, в период бурного развития БХ, был опубликован ряд статей с описанием методик и систем растворителей, предназначенных для разделения белковых гидролизатов или аминокислот, полученных из различных физиологических жидкостей (см. [51, 77]). Эти системы использовались для разделения сложных смесей аминокислот и пептидов и смесей аминокислот, с трудом поддающихся идентификации, например лейцин, изолейцин. С появлением автоматических аминокислотных анализаторов [120], а также новых ионообменников (см. гл. 5) БХ все реже и реже используют для анализа аминокислот и пептидов. В настоящее время в лабораториях, ведущих исследование белков, методом БХ проводят главным образом окончательную очистку простых смесей пептидов, полученных с помощью других методов разделения, кроме того, БХ служит одним из критериев однородности вещества (часто в сочетании с электрофорезом на бумаге), и только в считанных случаях ее применяют для идентификации отдельных аминокислот. [c.121]

Важнейшая характеристика всех белков — качественный и количественный аминокислотный состав их гидролизатов, который оценивается теперь преимущественно методами хроматографии и электрофореза. Эти методы разделения и идентификации суммы аминокислот достаточно многообразны и в ряде случаев отличаются высокой эффективностью. Ниже приводится один из упрощенных вариантов анализа гидролизата белка гороха при помощи хроматографии в тонком слое сорбента и электрофореза на бумаге. [c.245]

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

Для идентификации ДНС-аминокислот используют методы высоко- и средневольтного электрофореза на бумаге, тонкослойной хро- [c.149]

В 1973 г. Н. С. Егоровым была установлена полная структурная формула полимиксипа М с применением впервые разработанных методов специфического химического расщепления по остаткам треонина (метод К->0-ацильной миграции и окислительный метод ) [53]. Из смеси продуктов расщепления методом электрофореза выделены три К-Опр-пентида (рис. 3.5). Идентификация С-концевых аминокислот и аминокислотный анализ этих пептидов позволили определить их строение и с учетом ранге полученных данных по частичной структуре полимиксипа М [54,66] порядок их чередования в антибиотике [c.133]

ЧТО В молекуле фермента при взаимодействии с бромуксусной кислотой алкилируется один из гистидиновых остатков. Однако было известно, что молекула рибонуклеазы содержит четыре гистидиновых звена. При использовании меченой бромуксусной кислоты с последующим окислением и расщеплением алкилированного фермента на четыре крупных полипептидных осколка, которые были разделены методами электрофореза и хроматографии, был выделен пептид, содержащий меченую карбо-ксиметильную группу. В результате оказалось, что бромуксусная кислота алкилирует гистидиновое звено, расположенное в непосредственной близости к С-концевому остатку пептидной цепи фермента. Приведенный пример характерен тем, что показывает, какие результаты могут быть достигнуты при использовании в качестве модельных соединений ферментов, состав и последовательность аминокислот в молекулах которых известны, с привлечением меченых реагентов и наиболее современных и точных из известных методов разделения и идентификации пептидов. [c.338]

Химические, физико-химические свойства белков и их структура определяются аминокислотным составом. Поэтому исследование аминокислотного состава является важным аналитическим методом характеристики этих соединений. Исследование аминокислотного состава белков и пептидов включает расщепление этих соединений до свободных аминокислот, разделение последних, их идентификацию и количественное определение. Изучению аминокислотного состава предшествует, как правило, определение однородности изучаемых препаратов. О чистоте препаратов белка судят на основании данных ульт-рацентрифугирования, электрофореза, в частности диск-электрофореза ) [c.122]

Последовательность аминокислотных остатков в белковой цепи называется ее первичной структурой. Определение первичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь нежду определенными остатками. Так, трипсин режет лишь связи, образованные СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь пептидов — коротких фрагментов белковой цепи. Их идентификация производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, электрофорез). Воздействуя вторым ферментом, можно разрезать другие связи в белке и получить смесь других фрагментов (пептидов) и т. д. [c.33]

Первая стадия опре51 еления строения белка состоит в идентификации и количественном определении составляющих его аминокислот. Для этого требуется образец чистого белка, что само по себе представляет значительную проблему. Чтобы получить чистый образец, обычно применяют комбинацию методов (гл. 3), таких, как гель-электрофорез, ионообменная хроматография и центрифугирование по градиенту плотности (белки с большей молекулярной массой оседают быстрее, чем белки с меньшей молекулярной массой). Когда белок в результате применения этих методов становится однородным или когда достигнут максимум биологической активности, белок считается чистым. Тогда его гидролизуют до составляющих аминокислот горячей соляной кислотой и гидролизат анализируют. [c.267]

Электрофорез и электромиграцию можно использовать для разделения и идентификации микроколичеств материалов. Широкое использование этих методов, нанример в анализе аминокислот, белков, алкалоидов, красителей и их полупродуктов, сахаров и полисахаридов, хорошо известно. Применение этих методов в неорганическом анализе в некоторых случаях может иметь преимущество по сравнению с обычными методами. В этой связи может быть перспективным применение органических растворителей. Так, при электрофоретическом разделении в метанол — ацетонных смесях подвижность ионов резко отличается от подвижности в водных растворах, и Зг и Ва легко можно разделить, так же как отделить Zn от N1, Со и Мн [224]. [c.315]

Цитохром с из сердечной мышцы лошади был первым цитохромом, для которого установили полную аминокислотную последовательность. Гидролиз цитохрома с химотрипсином дал тринадцать больших пептидов, которые были разделены хроматографией на ионообменных смолах и очищены далее при помощи электрофореза и хроматографии на бумаге. Аминокислотная последовательность пептидов была установлена при помощи химических и ферментативных методов. Химические методы включали динитрофенилирование по Сэнджеру и деградацию по Эд-ману для идентификации N-концевых аминокислот, ферментативные — гидролиз лейцинаминопептидазой для определения N-концевых и карбоксипептидазой А для определения С-концевых аминокислот оба фермента использовались также для определения коротких аминокислотных последовательностей. [c.160]

Если изменение аллеля в локусе приводит к замене аминокислоты, принадлежащей к одному классу, на аминокислоту другого класса, то изменяется и изоэлектрическая точка белка, и его суммарный заряд при любом данном значении pH. Например, замена в молекуле ДНК кодона ААЦ на кодон ААА приведет к замещению нейтрального аспарагина положительно заряженным лизином. К еще более резкому изменению — замещению положительно заряженного лизина отрицательно заряженной глутаминовой кислотой — приведет замена ААГ на ГАГ. Подобные изменения суммарного заряда можно использовать для разделения белков, а следовательно, и для идентификации аллельных форм одного гена. Такое разделение достигается методом гель-электрофореза. [c.112]