Зонды рестрикционные фрагменты

Рестрикционный фрагмент, соответствующий зонду I,, предпочтительно расщепляется, а фрагмент, соответствующий зонду 2, - нет [c.381]

Прогулка по хромосоме -это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждав-щиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрикционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК-дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотических организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в нащих знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах. [c.288]

На основании каждой из трех приведенных моделей могут быть сделаны различные предсказания относительно размеров рестрикционных фрагментов (тестируемых с помощью гибридизационных зондов на последовательности типа У2 и С), образующихся при обработке препаратов эмбриональной ДНК и ДНК из клеток плазмы. Согласно модели (а), гены 1 2 и С должны в эмбриональной ДНК находиться на разных рестрикционных фрагментах. В препаратах ДНК из клеток плазмы будут обнаруживаться -содержащие фрагменты, аналогичные фрагментам эмбриональной ДНК, а также новые фрагменты, содержащие связанные между собой гены 1 2 и С. В отличие от этой мо- [c.290]

Альтернативный способ определения числа копий плазмиды— это анализ по Саузерну. Суммарную ДНК расщепляют рестриктазой и рестрикционные фрагменты фракционируют в геле. Затем ДНК переносят на нитроцеллюлозный фильтр п гибридизуют с зондом, представленным (обычно в единственном числе) как в геноме хозяина, так и в плазмидной ДНК- Количество копий плазмиды определяют путем денситометрии радиоавтографов. Здесь также следует учитывать относительную длину фрагментов и степень насыщения фрагментов меченой пробой. [c.233]

Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречаются парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/-, -/-) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке 1 можно использовать зонды, гибриди-зующиеся с другими участками ДНК между сайтами А и В (рис. 20.11, Г). Феномен, состоящий в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикционного сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (НДРФ). Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. [c.453]

Бурное развитие молекулярной генетики человека, начавшееся в 1980-х гг., стало возможным благодаря новаторским идеям Д. Ботштейна, Р. Уайта, М. Скол-ника и С. Дэвиса. Они обратили внимание, что полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) человека порождает полиморфные аллели (маркерные локусы), поддающиеся картированию. Как писали авторы в своей статье, мы хотим предложить новый способ построения генетической карты сцепления человека. В его основе лежит создание при помоши технологии рекомбинантных ДНК случайных однокопийных ДНК-зондов, способных выявлять полиморфные нуклеотидные последовательности при гибридизации с индивидуальными ДНК, обработанными рестриктазой . Более того, они осознали, что, используя сцепление гена того или иного заболевания с маркерным локусом, можно определить хро- [c.458]

Затем проводят радиоавтографию, помещая фильтр на рентгеновскую пленку. Радиоактивное излучение от любой полосы, с которой связался зонд, засветит пленку (рис. 25.32). Многие мутации приводят к делениям в хромосоме, что в свою очередь вызывает уменьщение длины рестрикционного фрагмента. Такой фрагмент более подвижен в геле и при радиоавтографии дает свою отдельную полосу. Таким способом можно вьывить ген серповидноклеточной анемии. [c.260]

Полиморфизм длины фрагментов рестрикции. Если имеется подходящий ДНК-зонд, то можно обнаружить прямым методом некоторые генетические болезни, возникающие вследствие мутаций (гемофилия, мыщечная дистрофия и др.). Ответственный за болезнь, но неидентифицированный ген может быть обнаружен, если он находится вблизи последовательности ДНК, поддающейся определению. Во всем человеческом геноме примерно одно из 150 оснований является полиморфным, т. е. варьируется у разных индивидуумов. Каждое щестое из этих случайных изменений или порождает, или разрушает участок рестрикции. В результате этого потенциальные участки рестрикции присутствуют вдоль молекулы ДНК с интервалом примерно в 1000 пар оснований. Их наличие или отсутствие у разных людей приводит к тому, что ДНК в процессе рестрикции разрезается на фрагменты разной длины (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Если при обследовании членов семьи обнаруживается взаимосвязь между полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов и наследственным заболеванием, делается заключение, что данный участок рестрикции расположен вблизи от гена, ответственного за патологию. В таком случае присутствие данного типа полиморфизма можно использовать для предсказания наличия мутантного гена у другого члена семьи или в ткани плода. Однако использование этой техники для пренатальной диагностики требует предварительного обследования семьи. [c.528]

Рис. 16.11. Обнаружение участков хромати-новой ДНК, чувствительных к расщеплению ДНКазой I. Рестрикционный фрагмент, выявляемый по гибридизации с зондом 1, устойчив к ДНКазе I, вероятно, ввиду защитного действия структуры соответствующего участка хроматина. Напротив, другой рестрикционный фрагмент, гибридизующийся с зондом 2, чувствителен к действию ДНКазы I. С увеличением концентрации фермента в реакционной смеси количество соответствующего фрагмента убывает.

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

ДНК-маркеры [560 953]. Интенсивные исследования по молекулярной генетике апо-липопротеинов и ферментов, вовлеченных в метаболизм липидов, привели к созданию ДНК-зондов для многих из этих генов. Зонды используются с разными целями. Сцепленный с локусом LDL-рецептора полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов [719] оказывается полезным для доклинической диагностики в тех семьях, в которых данные о повышении холестерина остаются не совсем ясными для интерпретации, но имеется по крайней мере один надежно диагностированный больной. Таким способом можно продемонстрировать и изоаллельную изменчивость LDL-рецептора (см. выше). Прямые диагностические зонды для дефектных генов LDL-рецепторов пока еще отсутствуют, и их создание представляет собой проблему (4.6.4). [c.304]

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

Проведя гибридизацию рестрикционных фрагментов, полученных прямо из клеток 5. typhimurium дикого типа и различных делеционных мутантов, можно выявить, какие из них гомологичны специфической ДНК-зонду. С помощью такой гибридизации можно определить как приблизительный порядок этих делеций на карте, так и положение их концов. [c.50]

Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу. После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК, меченной с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, мол<но определить размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной ДНК-зонду. [c.50]

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию [1—6], а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе [7—11]. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов <ПДРФ) [7]. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосред- [c.123]

На примере исследования гена, кодирующего фактор VIII, можно показать, как в настоящее время исследуется молекулярная природа наследственных изменений. Имея в распоряжении радиоактивную ДНК гена и смесь рестрикционных фрагментов геномной ДНК человека, страдающего гемофилией, можно провести электрофорез этой геномной ДНК и затем гибридизовать фрагменты с радиоактивным зондом. Если мутация затронула последовательность нуклеотидов какого-либо рестрикционного сайта, то картина распределения радиоактивных полос, выявляемых при электрофорезе, будет отличаться от той, которая получается для геномной ДНК здорового человека. Применяя этот метод, Р. Лон и Г. Вихар показали, что у разных больных-гемофиликов наблюдаются как точковые мутации — замены пар нуклеотидов, так и делеции различной длины (рис. 20.15). [c.522]

С целью выделения специфического зонда для прогулки вдоль хромосомы идентифицируют рестрикционный фрагмент, находящийся на конце вставки эукариотической ДНК. Такой фрагмент не должен содержать повторяющихся последовательностей ДНК- Это легко проверить путем гибридизации с суммарной ДНК мыши, используемой в качестве зонда для гибридизации по Саузерну. Этот зонд содержит космидную ДНК, гидролизованную различными ферментами (использованными для картирования). В нормальных условиях будут гибридизоваться лишь те рестрикционные фрагменты, которые содержат повторяющиеся последовательности ДНК (Steinmetz et al., 1980). Фрагменты, которые не гибридизуются и которые происходят из концевых областей вставки эукариотической ДНК, далее выделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, используя один из многочисленных имеющихся методов (Maniatis et al.. [c.34]

Выделенные фрагменты ДНК проверяют с помощью гибридизации с геномным саузерн-блотом. Гибридизацию проводят в присутствии немеченой эукариотической ДНК (50 мкг/мл), которая является конкурентом по отнощению к примесным повторяющимся последовательностям ДНК, присутствующим в зонде (разд. IV, Б). Далее, для того чтобы оценить чистоту зонда и подтвердить его локализацию на карте, проводят гибридизацию с блотом, содержащим рестрикционные фрагменты космидного клона. Фильтр, на котором идентифицировали малокопий-ные последовательности, может быть использован повторно, после того как меченую ДНК мыши отмыли в процессе двух 15-минутных инкубаций в растворе 0,lXSS , 0,1%-ноге ДСН при 90 °С. Выделенный фрагмент можно использовать для скрининга космидной библиотеки лишь в том случае, если оба эксперимента, включающие блот-гибридизацию по Саузерну, дают удовлетворительные результаты (нуклеотидная последовательность должна быть однокопийная и достаточно свободная от примесных рестрикционных фрагментов). [c.35]

ДНК-зонд с чередующейся последовательностью 5 -САСА... (или ОТ) гибридизуется со многими рестрикционными фрагментами ДНК всех эукариот, т. е. эта последовательность многократно повторяется в большинстве геномов. Возможно, она ответственна за образование 2-формы ДНК. [c.187]

Возникновение и выявление тандемных повторов в ДНК на примере амплификации гена AD. А. Схема амплификации и образования нового рестрикционного фрагмента на месте соединения генов (Е1 ЕЗ- соР1-сайты). Б. Блот-гибридизация по Саузерну соР1-фрагментов ДНК из нормальных и С-клеток (табл. 10.6). В качестве зонда использовали фрагмент гена AD левее сайта Е2. В ДНК из нормальных клеток с зондом гибридизуется один сегмент (его длина 8.5 т. п. н.), присутствующий [c.313]

Для небольших делеций гена или в случае, когда последовательность ДНК-зонда охватывает начало или конец делеции, генетическое нарушение можно установить путем идентификации характерных аномальных фрагментов ДНК на блотинговой пленке Саузерна. У носителя генетического нарушения будут наблюдаться как нормальные, так и аномальные полосы, а у больного человека-только аномальные. Таким способом можно выявить а-талассемию, используя а-глобиновый генный зонд, гибридизующийся в ДНК на участке, соседнем с началом делеции. Небольшие делеции, включающие всего несколько сотен пар оснований, можно детектировать по наличию аномальной полосы, которая располагается ниже полосы нормального рестрикционного фрагмента. Этим способом можно выявлять один из типов (3°-талассемии, обнаруженный только у индейцев (рис. 5.1.). [c.70]

Олигонуклеотидные зонды представляют собой синтетические одноцепочечные молекулы ДНК длиной приблизительно в 20 оснований. Такие зонды можно использовать для выявления точечных мутаций. Для этого требуется пара олигонуклеотидных зондов ОДИН комплементарный к нормальной и другой-к мутантной ДНК. Зонды гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК либо на блотинговых пленках Саузерна, либо в осушенном агарозном геле, и затем фильтр или гель промывают в таких условиях, чтобы плохо сопряженные ДНК-гибриды дестабилизировались и удалялись с фильтра, а гибриды из комплементарных молекул оставались на нем. Этот подход использовали для диагностирования серповидноклеточной анемии, Р-талассемии и а-1-антитрипсиндефицита [6, 13, 22]. [c.71]

Ряс. 7-23. Диаграммы гибридизации зонда из ДНК хлоропластов шпината с митохондриальной ДНК и ДНК хлоропластов из цуккини, кукурузы, шпината и гороха (задача 7-35). Столбики с индексом М относятся к митохондриальным ДНК с индексом Х -к ДНК хлоропластов. Рестрикционные фрагменты, с которыми гибри-дизовалась стандартная ДНК, показаны как темные полосы. [c.97]

Рис. 13-7. Результаты блот-гибри-дазации рестрикционных фрагментов гена ретинобластомы (задача 13-21). А. Картины гибридизации (Саузерн-блот) у здоровых людей и в случаях заболевания односторонней или двухсторонней ретинобластомой. Более светлая окраска полос указывает на вполовину меньшее, чем в норме, число юпий. Б. Расположение рестрикционных фрагментов. Фрагменты, содержащие экзоны (показанные в виде прямоугольников), гибридизуются с кДНК, использованной в качестве зонда в этих опытах.

Смотреть страницы где упоминается термин Зонды рестрикционные фрагменты: [c.145] [c.343] [c.287] [c.220] [c.222] [c.311] [c.333] [c.478] [c.138] [c.99] [c.114] [c.114] [c.74] [c.54] [c.455] [c.188] [c.188] [c.214] [c.287] [c.303] [c.351] [c.189] [c.250]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология